http://www.fungenomics.com/article/30 【专题】基因组学技术专题（二）—— 为什么说FPKM/RPKM是错的 下载数据 wget是linux下一个从网络上自动下载文件的常用自由工具。它支持HTTP，HTTPS和FTP协议，可以使用HTTP代理。一般的使用方法是: wget + 空格 + 参数 + 要下载文件的url路径，例如： 1wget http://www.linuxsense.org/xxxx/xxx.tar.gz Wget常用参数 -b：后台下载，Wget默认的是把文件下载到当前目录。 -O：将文件下载到指定的目录中。 -P：保存文件之前先创建指定名称的目录。 -t：尝试连接次数，当Wget无法与服务器建立连接时，尝试连接多少次。 -c：断点续传，如果下载中断，那么连接恢复时会从上次断点开始下载。 -r：使用递归下载 格式转换 // use sra-tools to transform > fastq-dump *.sra 为了后面分析方便，把相应的序列文件名改成相应的组 mv SRR1871481.fastq WT_Rep1.fastq 质量控制 Pre-Alignment QC 使用fastqc 软件来对原始序列fastq 文件进行质量检测 export PATH=/home/maque/FastQC/:$PATH fastqc *.fastq 这样每个 fastq 文件都能生成一个 html 报告文件，很详细 序列比对 使用 tophat 和 bowtie 进行比对 待添加 tophat2 -p 8 --bowtie1 -G genes.gtf -o WT_Rep1_output ../genome WT_Rep1.fastq 其他5个 fastq 文件与上面一致 -p 8 使用8线程 --bowtie1 使用bowtie1 , 默认是bowtie2 -G 后面跟注释文件 gtf -o 后跟输出文件夹 最后面跟 原始序列 fastq 文件 经完成比对，生成了一个 accepted_hits.bam 文件， 这个就是 samtools 生成的，后面主要也是利用这个文件继续分析。 建议提前利用 IGV 软件查看一下 该 bam 文件，可以知道mapping 的情况。 查看bam文件 如果想查看，需要先对 该bam文件进行 index ,比如： samtools index WT_Rep1_output/accepted_hits.bam Use Cufflinks to generate expression estimates from the SAM/BAM files Use Cufflinks to generate expression estimates from the SAM/BAM files ref export PATH=/home/maque/cufflinks-2.2.1.Linux_x86_64/:$PATH cufflinks -p 8 -o WT_Rep1_cuffout WT_Rep1_output/accepted_hits.bam 其他5个与之类似 -p 8 使用8线程 -o WT_Rep1_cuffout 输出目录 最后面跟相应的 bam 文件 该过程完成后，会生成相应的文件夹，里面有相应的文件，后面会使用 transcripts.gtf 文件 Differential Expression ref ls -1 *cuffout/transcripts.gtf > assembly_GTF_list.txt cuffmerge -p 8 -o merged -g Arabidopsis_thaliana_Ensembl_TAIR10/Arabidopsis_thaliana/Ensembl/TAIR10/Annotation/Genes/genes.gtf -s Arabidopsis_thaliana_Ensembl_TAIR10/Arabidopsis_thaliana/Ensembl/TAIR10/Sequence/WholeGenomeFasta/genome.fa assembly_GTF_list.txt -p 8 使用8线程 -o merged 后跟目录 -g 后跟参考基因的gtf文件 -s 后跟基因组序列文件 最后跟上一步新建的 assembly_GTF_list.txt 接下来使用 cuffdiff cuffdiff -o rna_de/diff_out -p 8 -L WT,athb merged/merged.gtf WT_Rep1_output/accepted_hits.bam,WT_Rep2_output/accepted_hits.bam,WT_Rep3_output/accepted_hits.bam athb_Rep1_output/accepted_hits.bam,athb_Rep2_output/accepted_hits.bam,athb_Rep3_output/accepted_hits.bam -o 后跟输出文件目录 -p 8 使用8线程 -L WT,athb '-L' tells cuffdiff the labels to use for samples 后跟 上一步由 cuffmerge 生成的 merged.gtf 文件 最后跟6个bam 文件， 组内由逗号隔开，组间由空格隔开。 该过程会新建一个diff_out 文件夹，里面包含了很多信息 这些信息可以使用 R 包 cummeRbund 很方便的进行分析 使用cummeRbund 文档 推荐流程 可以按照推荐流程文档中的步骤去分析 下面主要说一些注意点： 安装 source("http://bioconductor.org/biocLite.R") biocLite("cummeRbund") 读入数据 首先先 cd 到上一个步骤生成的 diff_out 文件夹 library(cummeRbund) cuff <- readCufflinks() 这样即完成读入数据。 各种分析图 可以按照推荐流程中的去分析，也可以参考 Nature Protocol 寻找差异表达基因 大部分进行RNA-Seq 实验的目的主要还是寻找实验组与对照组之间的差异表达基因。 一种方法是: mySigGeneIds<-getSig(cuff,alpha=0.05,level='genes') mySigGeneIds length(mySigGeneIds) mySigGenes<-getGenes(cuff,mySigGeneIds) mySigGenes diffData(mySigGenes) featureNames(mySigGenes) 另一种方法是： gene_diff_data <- diffData(genes(cuff)) sig_gene_data <- subset(gene_diff_data, (significant == 'yes')) sig_gene_data 这些方法列出的 gene_id 是像 XLOC_000268 这样的格式， 它所对应的通用的gene_id 比如AT1G06080 , 这种一一对应关系文件可以在合并的 merged.gtf 文件中寻找 而AT1G06080 这种gene_id 所对应的基因类型，基因名称等信息可以在 tair10 文件夹中的 gene.gtf 文件中找到 AT1G06080 这种gene_id 所对应的基因名称也可以在 同一文件夹中的 refFlat.txt 文件中找到。 也可以先把上一步输出的 gene_id 放到一个 list.txt 中，注意不要有空行，最好使用 vim , 然后利用 grep 即可： grep -f list.txt merged.gtf | less - S 以上就是rna-seq 数据分析的简单过程，很多细节没有提，而且还有很多其他步骤可以进行扩展，这些还需要再进一步深入理解。