RNA-seq最新利器——全长转录组测序

RNA-seq最新利器——全长转录组测序

 

1.三代测序技术PacBio SMRT Sequencing

2005年以来,转录组测序和研究的主流是基于NGS,即所谓的二代测序技术,虽然二代测序技术极大地提高了测序通量,且能够发现novel的转录本,但是由于其先天的缺陷,测序读长只能达到几百个碱基​​(MiSeq可以达到PE300),在转录组结构分析方面,往往效果不尽理想,譬如检测新转录本、寻找可变剪切等,由于需要用算法对转录本进行组装、重构,往往有较高的假阳性。随着三代测序平台PacBio的发展,测序读长已经能够达到平均10kb以上的读长,最大长度甚至能够大于40kb,覆盖了绝大部分典型基因的长度,因此能够很好的弥补由于读长产生的限制。

目前三代测序技术以PacBio RS II SMRT Sequencing为代表,即 Single-Molecule, Real-Time(SMRT) Sequencing,实时单分子测序,测得的序列即为一条转录本序列,无需再经过组装,且能够更加准确的检测可变剪切、新转录本、基因融合等。

以下是Pacbio平台的相关参数:​

表1 Pacbio平台相关参数

​​​​2.基于​PacBio的研究策略

以下为基于Pacbio测序的转录组研究流程​,与常规转录组研究流程区别不大,依次为样品RNA提取、文库制备、测序和信息分析。Pacbio对RNA的起始量要求较高(7ug),建议至少准备3个以上的文库,以覆盖不同长度范围的转录本,且目前建库方式只能是提取PolyA的方式建库。信息分析方面,除了不能定量之外,基本可以进行二代测序的所有分析。

图1 Pacbio研究流程

Pacbio ISO-seq(The PacBio isoform sequencing )为基于Pacbio的转录组测序策略,其流程如下:

图2 Pacbio ISO-seq实验流程

测序完成后,对下机数据进行基本的处理,得到转录本(isoform)序列文件,流程如下:

图3 Pacbio数据处理

3.全长转录组研究案例

以下分享玉米全长转录组研究,​该项目发表于2016年6月, Wang, B. et al. Unveiling the complexity of the maize transcriptome by single-molecule long-read sequencing. Nat. Commun. 7:11708 doi: 10.1038/ncomms11708 (2016).

(1)研究策略​

图4 玉米全长转录组研究流程

(2)研究结果

该项目共提取6个不同组织,每个样品的RNA加上barcode序列后,混合总RNA建库,建库长度分为6个长度范围(六个文库),每个文库测7-9个cell,以下是测序reads的长度分布,以及与参考数据库的比较。​

​​图5 RNA提取和测序结果

 表2  六个文库的测序量与长度分布​

通过tofu套件对下机数据进行基本的处理后,可以得到全长转录本序列,并且由于每个组织样品有加上barcode序列,可以得到每个组织特有的Isoform。

 图6  样品特有的Isoform鉴定及可变剪切检测

项目对检测的新转录本通过PLEK做了lncRNA预测,并对预测的lncRNA进行来源分类、exon个数分类、长度分类,以及组织间的overlap分析。文章中发现玉米lncRNA有如下特点:

1)鉴定的novelRNA长度整体较长(可能是得益于Pacbio研究平台);

2)大多数lncRNA来源于基因间区;

3)大多数lncRNA为单外显子基因;

4)LncRNA表达量普遍比mRNA低。

图7 lncRNA相关分析

此外,该项目对比了Pacbio测序结果和二代测序结果得到的转录本数据,发现无论是cufflinks还是Trinity,都只能组装得到少数的全长转录本,证实三代测序能够得到更为全面的转录组序列信息。

图8 二代测序组装的转录本与三代测序结果的比较

​(3)文章结论

​1)通过Pacbio测序,能够发现大量的新转录本(57%),因而能够完善基因注释集,并且转录本平均长度显著高于原注释集;

2)Pacbio测序鉴定大量可变剪切,splice site与二代测序数据吻合度较好(90%),剪切位点(acceptor sites,donor sites)的甲基化能够影响剪切体的形成;

3)能够鉴定大量的lncRNA,长度超过原注释集的2倍;

4)鉴定大量的基因融合,且发现反式剪切是形成融合基因的主要原因,inter-chromosomal为主要融合来源。

5)Pacbio测序较二代测序能够得到更加完整的转录本信息。

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转载自blog.csdn.net/u010608296/article/details/89738656