用各种分子生物法分析婴幼儿肠道微生物

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中文标题：用各种分子生物法分析婴幼儿肠道微生物
日文标题：各種分子生物学的手法による乳幼児腸内細菌叢の解析
作者信息：中山二郎 (九州大学教授）
通信作者：園元謙二
通信地址：九州大学大学院农学研究院生物机能科学部门

背景和目的

许多研究表明益生菌可以改善或预防过敏性疾病。然而，在没有益生菌干预的情况下，研究过敏人群和非过敏人群细菌组成差异的研究并不多。在日本，有10%到20%的人口有过敏疾病。比如，食物过敏，在出生后的两年内发生食物过敏，哮喘以及特应性皮炎等。有相当多的证据表明，早期肠道菌群的发育对免疫系统的发育有很大的影响。然而，由于生活方式或遗传因素也会影响过敏的发展，因此需要进行大规模的流行病学调查，才能准确了解过敏与肠道菌群之间的关系。要实现这一目标，就必须要建立粪便微生物组成的高通量分析体系。在本报告中，作者比较了各种功能分子在流行病学分析中的适用性。

方法和结果

基因库的随机测序
采用一套通用引物PCR法从粪便样品中提取微生物组的总DNA，并扩增16S rRNA基因片段。将扩增产物克隆到大肠杆菌中来构建16S rRNA库。对多个克隆进行随机测序，并对数据库进同源性搜索。该结果可提供高度可靠的菌种鉴定和粗略估计微生物组成的组成。这个方法除了DNA测序设备外，不需要任何特殊的技术和仪器。作者从9个婴儿中获得的大约500个序列，对应于大约50个核型，大多数ribotypes显示超过97%的菌群可以被识别，表明大多数新生儿肠道中的微生物组组成和培养的微生物组组成相对应，并且这和成年人的肠道微生物组不一样。
DGGE法
PCR扩增是以粪便中提取的总DNA为模板的，其中一组引物含有GC-clamp。作者使用HDA1和HDA2引物来对V2-V3区域进行扩增。电泳是在8%聚丙烯酰胺凝胶和变形剂梯度的30%~65%中进行的，其可以完全地对7M尿素和40% 甲酰胺进行应答。DGGE凝胶中分离的条带是通过比较条带位置与参考标记的条带位置或从凝胶中分离的DNA片段来确定的。作者监测了9例新生儿肠道微生物组的组成变化。发现7名受试者（2名除外）经抗生素处理之后呈现出了从好氧微生物到厌氧微生物生态系统变化。根据实验结果可知，DGGE虽然需要熟练的操作技术但是对于快速的进行多样性评估和比较分析是非常有用的。
T-RFLP法
PCR扩增是以粪便样品中提取的微生物组总的DNA为模板，采用荧光标记的通用引物来进行扩增。扩增子混合物经几种酶消化后，在DNA测序凝胶中测定标记端片段的长度。然后再结合限制性片段长度的数据库来推导微生物组的组成。作者使用8UA和519B引物通过Hhal，Rsal和MSPI来对V1-V3区域进行扩增并消化扩增子。该方法的优点是利用序列数据库代替参考标记法来进行细菌鉴定，并可应用于多毛细管DNA测序仪的高通量分析。缺点是对微生物鉴定有时是含糊不清的，因为在某些情况下不同的属细菌会产生相同的限制片段。作者采用T-RFLR法对28例婴幼儿肠道卫生区组进行了分析并且获得的肠道微生物组组成的个体概况。
Real-time PCR法
PCR扩增是以粪便样品中提取的总微生物组DNA为模板的，通过组特异性引物来来进行扩增，从而实现实时定量扩增DNA的目的，通过与连续稀释标准DNA的扩增谱来进行比较，从而估算出样品中16s rDNA的靶点。这种方法可以精确的对复杂生态系统中的目标微生物进行定量。但是这种方法的确定是，对于每一个目标都需要设定一套特异性引物以及需要对PCR的条件进行优化。

讨论

DGGE和T-RFLP难以应用于高通量系统，不适合流行病学的研究或临床诊断。Real-time PCR、FISH(荧光原位杂交)和流式细胞术在以特定细菌为目标的高通量分析中具有广阔的应用前景。然而，为了在流行病学项目下研究全球细菌群落，我们应该进一步研究上述四种方法的潜在可能性，以及DNA微阵列和流式细胞术。

参考文献

P. Songiinda, J. Nakayama, Y. Kuroki, S. Tanaka. S. Fukuda C. Kiyohara, T. Yamamoto, K. lzuchi, T.
Shirakawa and K. Sonomoto, “Molecular monitoring of the developmenta1 bacterial community in the gastrointestinal tract of Japanese infants” Biosci. Biochem. Biotechnol.
J. Nakayama M. Fukui, P. Songi inda S. Tanaka R. Kunugi, K. Sonomoto, “Analysis of the composition of the intestinal flora: Analysis of intestinal bacterial community by DGGEITGGE” J. lntestinal Microbiol.

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