在上个笔记中，我们主要介绍了现在进行DNA甲基化比对的策略和方法中的第一种以bismark为代表的Three Letter Alignment方法：DNA甲基化分析----------甲基化比对软件专题（Bismark），那么我们今天就来就另一种比对方法Wild Card Alignment进行初步的了解~
-------------------------------------------------------分割君上线-------------------------------------------
那么我们肯定会好奇，什么是Wild Card Alignment? 原理是什么样的呢？如何实现呢？我们首先来看看需要解决的问题：
1：因为亚硫酸氢盐处理，导致序列的正链和负链并不互补，因为亚硫酸氢盐的转化只发生在未甲基化的Cs上。
2：因为未甲基化的C在BS转化的过程中全部都变成了T，导致了测序后的C比例明显减少了。
3：第三，C到T的mapping是不对称的。亚硫酸氢盐转化后的T可以映射到参考基因组中的C或T，但是C只能mapping到C。
为了解决这些问题，开发者们想出的策略，具体出处见原文献：
策略一：为了提高精度，BSMAP是基于更高效的哈希表seed算法，它索引所有可能的k-mers的引用，称为种子，只搜索种子与部分读取完全匹配的位置。
步骤一：建立全基因组的index，主要是为了记录下参考基因组的位置，并且知道所有的C的位置的信息。
步骤二：然后选取seed。
步骤三：将seed进行BS转化，列出所有的可能。
步骤四：将测序出来的reads进行序列比对，然后只选出最佳匹配出的结果 。
步骤五：将对应的key-value（就是位置信息）记录下来。
实现步骤
策略二：以最佳匹配的seed为基础进行链延伸，然后进行序列比对。然后根据分数匹配看看是match还是missmatch。（这里有一个打分编码的系统表。）
打分结果
打分编码表
----------------------------------------------------------分割线---------------------------------------------
那么Wild Card Alignment方法是什么呢？那么mapping的结果怎么看呢？
开发者们利用了一种碱基Y来替换成了参考基因组上的C（所有的C，包括甲基化和未甲基化的的C），然后测序后C或者是T都可以匹配的上Y。我们来看一个小栗子：
（PS：比对的策略的还是和三碱基法类似，如果一个reads可以比对到多个位置，那么直接舍去。）
Summary：
含有甲基化胞嘧啶的reads可以含有四种碱基，而含有非甲基化胞嘧啶的reads可能只含有三种碱基，从而导致序列特异性的降低，使含有非甲基化胞嘧啶的reads比对率降低，在计算甲基化水平时引入偏倚，造成甲基化水平的升高，但是其整体的比对率高于three-letter法。
Reference:
1:Analysing and interpreting DNA methylation data
https://www.nature.com/articles/nrg3273
2:BSMAP: whole genome bisulfite sequence MAPping program
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2724425/