一文读懂：DNA甲基化的作用及各种高通量检测方法比较

DNA甲基化相关定义

DNA甲基化一直以来都是表观遗传学领域研究的重点之一。DNA甲基化（Methylation）是指在DNA甲基转移酶（DNA methyltransferase, 缩写DNMT）的作用下，基因组DNA序列上CpG岛的二核苷酸5′端胞嘧啶转变为5′甲基胞嘧啶（5′ methylcytosine, 缩写5mC）。这种DNA修饰的方式并未改变基因的序列, 但能抑制某些基因的表达。在哺乳动物中，基因组DNA的甲基化可分为两种类型：维持甲基化（maintenance DNA methylation）和重新甲基化（de novo methylation）。

维持甲基化是指在甲基转移酶的作用下，DNA的半保留复制过程中，会在子链的相应的位置进行甲基化修饰的过程。重新甲基化是指在甲基转移酶的作用下，原来没有甲基化的DNA双链上，进行甲基化的过程，之后由维持甲基化酶来维持稳定的DNA甲基化状态。对于这两种甲基化机制来说，有两种对应类型的甲基化酶：维持甲基转移酶和重新甲基转移酶。在哺乳动物中，较为常见的DNA甲基化转移酶(DNMT)主要有：DNMTl、DNMT3a、DNMT3b。而去甲基化则可诱导基因的重新活化和表达。

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胞嘧啶甲基化和去甲基化机器的结构域及酶活性（Wu et al. 2014, Cell）

DNA甲基化的作用

DNA甲基化的生物学功能主要可以分为三类：

1）基因组序列C-->T的突变，如很多实体瘤患者出现抑癌基因p53 的突变, 而该基因的很多突变是CpG甲基化后脱氨引起的C-->T突变；

2）影响基因组错配的修复，研究表明DNA错配修复系统(mismatchrepairsystem, MMR)与DNA甲基化有关；

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3）基因沉默，即影响基因的表达。

在真核生物中，大约60%~90%的CpG 二核苷酸中的胞嘧啶都呈现出了甲基化状态(Ehrlich et al., 1982)。DNA甲基化在维持正常细胞的功能、雌性个体X染色体失活、寄生DNA序列的抑制、基因组结构稳定、遗传印记、胚胎发育、及肿瘤和疾病的发生、发展紧密相关，具有至关重要的作用。已有的研究表明胚胎的正常发育非常依赖于基因组DNA的适当甲基化，任何一种甲基转移酶的缺失，都可导致小鼠胚胎发育的中止而死亡。此外，各种肿瘤中都普遍存在DNA甲基化状态的异常改变，且异常的DNA甲基化状态是肿瘤的重要特征之一。小鼠的体外实验和体内实验都已表明，全基因组水平的去甲基化可能导致整个基因组的不稳定，从而增加肿瘤的发生几率。而且，抑癌基因启动子区域CpG 岛的高甲基化，是诸多癌症发生早期的重要事件之一。因此，探索肿瘤中DNA 的去甲基化的机制对于了解肿瘤的发生、发展至关重要。

DNA甲基化与癌症的关系（Robertson KD, Nat Rev Genet. 2005）

DNA甲基化的检测

至今，DNA甲基化检测技术已经有了突飞猛进的变化，若按照“样品前处理”的方式，则可分为：

1）酶切法(Enzyme digestion)；

2）亲和富集法(Affinity enrichment)；

3）亚硫酸盐处理(Sodium bisulphite)；

三种类型方法的综合比较（Barros-Silva et al. Genes, 2018）

而按照“分析步骤”则又可细分为：

1）位点特异性分析(Locus-specific analysis)；

2）凝胶分析(Gel-based analysis)；

3）全基因组高覆盖率的芯片分析(Array—based analysis)；

4）基于新一代测序技术的甲基化分析(NGS-based analysis)。

具体如下图所示：

主要的DNA甲基化研究方法（Peter W. Laird, Nat Rev Genet. 2010）。缩写与全称为：AIMS, amplification of inter-methylated sites; BC–seq, bisulphite conversion followed by capture and sequencing; BiMP, bisulphitemethylation profiling; BS, bisulphite sequencing; BSPP, bisulphite padlock probes; CHARM, comprehensive high-throughput arraysfor relative methylation; COBRA, combined bisulphite restriction analysis; DMH, differential methylation hybridization; HELP, HpaIItiny fragment enrichment by ligation-mediated PCR; MCA, methylated CpG island amplification; MCAM, MCA with microarrayhybridization; MeDIP, mDIP and mCIP, methylated DNA immunoprecipitation; MIRA, methylated CpG island recovery assay;MMASS, microarray-based methylation assessment of single samples; MS-AP-PCR, methylation-sensitive arbitrarily primed PCR;MSCC, methylation-sensitive cut counting; MSP, methylation-specific PCR; MS-SNuPE, methylation-sensitive single nucleotideprimer extension; NGS, next-generation sequencing; RLGS, restriction landmark genome scanning; RRBS, reduced representationbisulphite sequencing; –seq, followed by sequencing; WGSBS, whole-genome shotgun bisulphite sequencing.

随着测序技术的发展，测序价格越来越低，而通量越来越高，且测序可实现单碱基的分辨率，基于测序的甲基化检测技术已逐渐成为主流。下图展示了基于测序的DNA甲基化解析技术的发展流程：

基于二代测序的DNA甲基化检测技术发展历程（Barros-Silva et al. Genes, 2018）。缩写与全称：BS-Seq: bisulfite sequencing; MeDIP-Seq: methylated DNA immunoprecipitation sequencing;RRBS-Seq: reduced representation bisulfite sequencing; WGBS: whole genome bisulfite sequencing;MethylCap-Seq: methylation capture sequencing; MBD-Seq: methyl-CpG binding domain sequencing;oxBS.Seq: oxidative bisulfite sequencing; TAB-Seq: TET-associated bisulfite sequencing; BSAS: bisulfiteamplicon sequencing.

常用的甲基化检测方法具体如下图所示：

常用的甲基化检测方法示意图（Yong et al. Epigenetics & Chromatin, 2016）

 

1）蛋白质富集全基因组甲基化测序（Methylated DNA Binding Domain Sequencing, MBD-Seq或MBDCap-seq）

为一种采用甲基化DNA富集与高通量测序技术相结合的DNA甲基化检测方法。主要通过特异性结合甲基化DNA的蛋白MBD2b去富集高甲基化的DNA片段，然后结合高通量测序技术，对富集到的DNA片段进行测序，从而可在全基因组范围内检测甲基化位点。

2）甲基化DNA免疫共沉淀测序（Methylated DNA Immunoprecipitation Sequencing, MeDIP-Seq）

其采用的甲基化DNA免疫共沉淀技术。首先通过5'-甲基胞嘧啶抗体去特异性富集基因组上发生甲基化的DNA片段，接着通过高通量测序在全基因组水平上对CpG密集的高甲基化区域进行研究。这种技术可以发现基因组中高度甲基化的区域，如CpG岛，但不能进行单个碱基水平的分析。

3）TET辅助的重亚硫酸盐测序(TAB-seq) 

原理是采用葡萄糖亚胺与5’羟甲基胞嘧啶(5’hmC)作用使其免受TET蛋白的氧化。而5’甲基胞嘧啶和未甲基化的胞嘧啶被脱氨基成尿嘧啶，从而可从单碱基水平鉴定5’羟甲基胞嘧啶(5’hmC)。

4）限制性内切酶-重亚硫酸盐靶向测序（Reduced Representation Bisulfite Sequencing，RRBS）

RRBS通过限制性内切酶对基因组DNA序列进行酶切，然后富集启动子及CpG岛区域，接着再进行Bisulfite转化，从而用较小的数据量就可得到包含最多CpG位点的单碱基水平的甲基化图谱。总的来说，是一种准确且高性价比的DNA甲基化检测方法，适用于大规模临床样本的研究。

5）全基因组DNA甲基化测序（Whole-genome bisulfite sequencing，WGBS）

其原理是用 Bisulfite 处理DNA序列，首先将基因组中未发生甲基化的 C 碱基转换成 U（T），从而与原本具有甲基化修饰的  碱基C区分开来，然后进行PCR扩增，结合高通量测序技术，适用于全基因组 范围内绘制单碱基分辨率的DNA 甲基化图谱。

下表列出了不同甲基化检测技术的特点，及可能存在的bias：

不同甲基化检测技术的特点及可能的bias（Peter W. Laird, Nat Rev Genet. 2010）。标注含义：‘•’ indicates that the method has this feature or potentially has this bias; ‘(•)’ indicates that the method has this feature to a limited extent or in some circumstances.BC–seq, bisulphite conversion followed by capture and sequencing; BSPP, bisulphite padlock probes; –chip, followed by microarray; MeDIP, methylated DNAimmunoprecipitation; RRBS, reduced representation bisulphite sequencing; –seq, followed by sequencing; WGSBS, whole-genome shotgun bisulphite sequencing.

此外，不同甲基化检测技术，拥有不同通量和基因组甲基化检测覆盖度，具体如下图所示：

甲基化检测技术的样本通量及基因组覆盖度比较（Peter W. Laird, Nat Rev Genet. 2010）

所以，各种甲基化检测技术都有自己的优点和缺点，其中全基因组DNA甲基化测序（WGBS）可获得全基因组范围内单碱基分辨率的所有DNA甲基化情况，信息最为丰富和全面。

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