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2016年10月，温州医科大学检验医学院（生命科学学院）丁春明研究员及团队在《Molecular Metabolism》杂志发表题为“Dynamic DNA methylation landscape defines brown and white cell specificity during adipogenesis”的研究文章，该研究通过简化基因组甲基化测序（RRBS）及对应的转录组测序（RNA-seq）揭示了脂肪形成过程中棕色细胞（BAT）和白色细胞（WAT）的特异性发育。
标题：Dynamic DNA methylation landscape defines brown and white cell specificity during adipogenesis基于动态DNA甲基化图谱观察脂肪形成过程中棕色和白色细胞的特异性
时间：2016-10
期刊：Molecular Metabolism
影响因子：IF 8.568
技术平台：RRBS、RNA-seq、qPCR等
研究目的：
白色脂肪组织(white adipose tissues，WAT)主要是在饥饿期间以甘油三酯的形式储存能量以提供燃料，而棕色脂肪组织(brown adipose tissues，BAT)则是非寒战产热的主要器官，最近研究也表明了第三种脂肪细胞的存在，即米色脂肪细胞。为阐明WAT和BAT细胞谱系特异性发育的分子机制被视为脂肪生物学研究的关键领域，本研究分析了WAT和BAT在分化过程中的DNA甲基化组，并认为DNA甲基化可能是确定脂肪细胞谱系中一个稳定的表观遗传因素。
项目设计：
（1）样本选取：
以从BL6小鼠肩胛间区和腹股沟区脂肪组织中分离出的WAT和BAT为样本。
（2）项目设计流程图：
3、实验结果
（1）脂肪形成模型的DNA甲基化概况
从8只BL6小鼠肩胛间区和腹股沟区的脂肪组织中分离出WAT和BAT，并用去甲肾上腺素(NE)处理WAT5天，用NE急性处理BAT4小时，以诱导关键标记物的表达。通过实时定量PCR检测各模型在不同分化阶段的泛成脂标记(AdipoQ、Fabp4、Pparg)和特异性标记(Pgc1a、Ucp1、Cidea)的表达，验证各模型的生物学有效性。此外，为探究DNA甲基组和转录组可能编码的生物信息，研究人员对这两个数据集进行了主成分分析和层次聚类，揭示了样品的分化状态与脂质代谢的功能专一化有关。值得注意的是，WAT和BAT的NE处理并没有改变它们基于DNA甲基化的聚类模式。因此，研究人员认为DNA甲基化标记代表了不同细胞系稳定的表观遗传标记。
（2）DNA甲基化组在脂肪形成过程中的变化
在单个CpG和基因组水平的分化过程中检测DNA甲基化谱的变化。首先，所有被分析的CpG被分为低甲基化(LM)、部分甲基化(PM)和高甲基化(HM)三类。在WAT和BAT形成过程中，LM的CpGs降低，而PM和HM的CpGs相应增加。对每个CpG甲基化差异的评估显示，高甲基化CpG的丰度始终高于低甲基化CpG。这表明，在WAT和BAT脂肪形成过程中DNA甲基化的整体增加。尽管大多数显著差异甲基化的CPG(DMC)位于内含子和基因间区域，但高甲基化的CPG在启动子区域最为显著。有趣的是，WAT和BAT形成过程中显著差异甲基化启动子(DMP)的独立功能富集分析(第0天和第4天)显示，细胞增殖和分化显著富集。
（3）BAT和WAT在脂肪形成过程中的系统差异
BAT和WAT的时间匹配比较显示高甲基化的CPG明显高于低甲基化的CPG。与脂肪形成时间过程分析的结果相似，显著甲基化CPG(DMCs)大多位于内含子或基因间区域。然而，与脂肪形成时间过程分析不同的是，低甲基化DMC(相对于WAT)在外显子区域占主导地位。
（4）启动子甲基化与基因表达普遍呈负相关
本研究从RNA-seq数据中获得的转录组数据，对BAT和WAT形成过程中受调控的基因进行GO分析，发现BAT和WAT形成过程中受调控的基因分别在线粒体呼吸链和脂质代谢过程中显著富集，相对于成熟WAT，成熟BAT中GO的最高上调为线粒体呼吸链和脂肪酸氧化。在比较WAT和BAT两种类型以及不同时间形成脂肪的细胞时，发现启动子甲基化与基因表达呈整体负相关。
（5）Hox家族基因在棕色和白色脂肪形成中甲基化的差异一致
当比较BAT和WAT在脂肪形成的所有三个时间点时，结果发现了31个DNA甲基化显著变化的基因，WAT与BAT相比，分别有23个高甲基化和8个低甲基化，其中一类重要的转录因子Hox家族基因显著富集，包括Hoxa2、Hoxa5、Hoxc4、Hoxc9和Hoxc10。Hox基因成员是转录因子的一个超家族，在序列和功能上都高度保守。有趣的是，对于所有这5个Hox基因，RNA-seq的基因表达与甲基化模式呈负相关。Hoxa2、Hoxa5和Hoxc4在BAT中富集，这与它们的高甲基化是一致的，而Hoxc9和Hoxc10在BAT中表达较低，这与它们的低甲基化是一致的。
为了测试这些基因在小鼠和人类之间的表达模式是否保守，本研究检查了从成人皮下和胎儿棕色脂肪中获得的RNA-seq数据。与小鼠体外和体内模型一致，Hoxc9和Hoxc10在人类中表现出组织特异性表达。
（6）5- Aza-cytidine对Hox基因启动子DNA甲基化的抑制可上调基因表达
最后，研究在甲基化阻断剂5-Aza-cytidine的作用下诱导白色和棕色前脂肪细胞分化五天。在5- Aza-cytidine诱导的去甲基化过程中，Hoxa2和Hoxa5在其启动子高甲基化的WAT中显著上调，而在其启动子低甲基化的BAT中则不上调。Hoxc9和Hoxc10在BAT中的上调程度高于WAT，可能与它们在BAT中的高甲基化有关。Hoxc10被选择作进一步分析，因为它在去甲基化时表现出最显著的表达变化，最近的数据表明它是WAT中BAT标记物表达的抑制因子。在另一个单独的实验中，用5-Aza处理分化成熟的棕色脂肪细胞3天，在这两种情况下都检测到Hoxc10的上调，这表明去甲基化导致Hoxc10上调可能是一种因果作用，与分化过程无关。
关键图形
Figure 3: Promoter methylation differences for five Hox genes were associated with gene expression differences between white and brown adipocytes during adipogenesis.
Figure 4: Inhibition of DNA methylation in Hox gene promoters by 5 Aza-cytidine treatment alters gene expression.
结论
本研究通过RRBS、RNA-seq等组学分析表明，DNA甲基化是分化前、分化过程中和分化后棕色和白色细胞谱系的稳定表观遗传特征。本研究共鉴定出31个基因的启动子在分化的所有三个时间点在白色和棕色脂肪形成之间的显著差异甲基化。其中五个基因属于Hox家族，其表达水平与启动子甲基化呈负相关，表明DNA甲基化在转录中的调控作用。用5- Aza-cytidine阻断DNA甲基化导致这些基因表达上调，对Hoxc10（BAT标记物表达抑制因子）具有显著作用。总之，研究数据表明，DNA甲基化可能在脂肪细胞的谱系特异性发育中发挥重要作用。
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简化甲基化测序(Reduced Representation Bisulfite Sequencing,RRBS)是利用限制性内切酶对基因组进行酶切，富集启动子及CpG岛等重要的表观调控区域并进行重亚硫酸盐测序。该技术显著提高了高CpG区域的测序深度，在CpG岛、启动子区域和增强子元件区域可以获得高精度的分辨率，是一种准确、高效、经济的DNA甲基化研究方法，在大规模临床样本的研究中具有广泛的应用前景。
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技术优势：
起始量：100ng gDNA；
单碱基分辨率；
多样本的覆盖区域重复性可达到85%-95%、测序区域针对高CpG调控区域，数据利用率更高；
针对性强，成本较低；
基因组CG位点覆盖高达10-15M，显著优于850K芯片。
应用方向：
RRBS/dRRBS/XRBS广泛应用于动物，要求全基因组扫描（覆盖关键调控位点）的：
队列研究、疾病分子分型、临床样本的甲基化 Biomarker 筛选
复杂疾病及肿瘤发病机制等甲基化研究
模式动物发育和疾病甲基化研究
技术参数 |
RRBS |
DRRBS |
cfDNA-RBS |
Micro-RBS |
sc-RBS |
原理 |
MspI酶切+连接接头 |
多酶切+连接接头 |
CCGG邻近片段连接接头 |
CCGG邻近片段连接接头 |
CCGG邻近片段连接接头 |
样本要求 |
1μg |
1μg |
1ng |
1ng |
单细胞/1-10个细胞 |
测序数据量 |
10G |
15G |
20G |
20G |
2G |
5XCG位点覆盖 |
6M |
8M |
6M |
10M |
4-8M |
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参考文献：
Lim YC, Chia SY, Jin S, Han W, Ding C, Sun L. Dynamic DNA methylation landscape defines brown and white cell specificity during adipogenesis. Mol Metab. 2016 Oct;5(10):1033-1041.
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