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Microbiome: 应用多维宏组学方法协同揭示复杂细菌群落对目标底物代谢的菌间相互关系
香港大学张彤教授团队与北京大学余珂博士研究团队，以生物降解菌群为研究模型，运用多维宏组学方法（宏基因组、宏转录组及目标性代谢组学联合）解析混合微生物群落内细菌间协同代谢关系。研究成果以“An integrated meta-omics approach reveals substrates involved in synergistic interactions in a bisphenol A (BPA)-degrading microbial community”于2019年2月6日以研究论文（Research Article）的形式在国际微生物学权威期刊Microbiome（IF：9.13）上在线发表。
背景解读
微生物相互作用(microbial interaction)是自然生态环境或人造环境的微生物生化过程至关重要的实现方式。理解不同微生物间在生长过程中产生的物质交换（material exchange），可协助研究者理解不同菌种间的竞争或合作关系，有助于发现构建合理的微生物群落所需的关键环境因子，对于开发提高复合微生物群落的性能的策略，以及开发监测、预测生物过程的工具至关重要。然而，揭示复杂微生物群落中菌间互作具有挑战性。因识别在复杂的群落中不同代谢过程中起代谢作用的微生物以及个体的生理特性、代谢能力和活性状态严重依赖于微生物的分离技术，且分离微生物往往难以得到理想效果，以致于细菌相互作用的研究往往难以进行。
多种宏组学（meta-omics）的联用有可能应用于快速对复杂微生物群落中的菌间关系进行预测，但由于多种宏组学技术联合使用极其复杂，合理的流程和研究方式有待探讨。为了构建准确预测菌间相互关系的宏组学的分析流程，本研究以降解菌群–双酚A（BPA）微生物降解为研究模型，利用
1). 宏基因组学（metagenomics）恢复菌群中主要微生物的功能潜能以预测其参与的生理过程；
2). 宏转录组学(metatranscriptomics)分析特定时期主要细菌的表达谱并推测其在不同阶段激活的代谢通路;
3). 目标性代谢组学（targeted metabolomics）以菌群整体为目标检测在特定时期的代谢产物；并综合三种宏组学数据的预测结果，
4). 预测不同阶段菌间的物质交换以推测相互关系。
而后，以成功分离培养部分主要细菌并以此进行单独培养（pure culture）及共培养（co-culture），以验证所预测的菌间相互关系。研究证明，多维宏组学分析比单一宏组学数据更能对微生物群落有更深入和透彻的理解，可准确预测群落内微生物的共生或竞争等关系。
本文建立了一个综合的多维宏组学的分析体系，成功解译BPA降解群落中微生物的代谢能力和相互作用。该论文所构建的多维宏组学分析流程不仅适用于环境工程体系中微生物相互关系的预测，同样对其他自然环境或肠道微生物菌间相互关系的研究有启示性作用。
综合宏组学分析流程
本文提供了一种综合利用多种宏组学数据（宏基因组学，宏转录组学，目标代谢组学），并通过分离纯菌进行验证研究混合微生物群落中不同细菌的代谢能力及相互关系的方法（图1）。关键分析流程如下：
1）利用液相双质谱（LC-MS/MS）检测中间代谢产物，结合宏基因数据所预测的菌群整体代谢途径重建BPA降解代谢通路；
2）以16S rRNA 基因分析确定细菌丰度，并利用宏基因组分箱技术（binning）预测优势物种基因组的代谢潜力；
3）以宏转录组数据获得优势物种的基因表达谱，预测不同优势种在特定时期的BPA相关代谢途径的激活情况，以推测每个物种在BPA降解不同阶段中的角色；
4）从富集微生物群落中分离优势物种验证从宏组学数据中揭示代谢网络。
图1. 本研究中实验设计和综合宏组学分析流程
一、代谢产物分析和宏基因功能注释重建群落水平的代谢通路
对BPA代谢途径的重构通过两方面进行：
1). 利用LC-MS/MS检测BPA及其已知代谢产物在降解过程中的降解行为。表明微生物群落主要通过2种代谢通路对BPA进行降解。而后分别加入BPA的中间代谢产物以解析BPA中间代谢产物的下游代谢途;
2).由于LC-MS/MS检测不到任何下游代谢产物，无法只根据代谢学建立完整的BPA降解通路，故利用宏基因组功能预测结果，重构下游代谢途径，以获得完整的BPA降解途径（图2e）。
图2. 群落水平的BPA降解和代谢通路
二、宏基因组学和宏转录组学预测微生物群落中单个微生物在BPA降解不同时期的作用
以BPA为唯一碳源，在BPA降解的四个阶段进行DNA样本、RNA样本的采集，进行扩增子（16S rRNA基因）、宏基因组及宏转录组测序。宏基因组数据组装获得组装重叠群（contigs）并利用binning获取基因组。使用BLASTp比对NCBI-non-redundant protein sequences, KEGG 及Brenda等多个数据库预测基因功能。利用GTDB对全基因组序列进行分类注释。根据基因组完整度、基因功能注释比例及以16S rRNA 基因测序所获的物种丰度信息，推测四种具有高完整度基因组的细菌参与了BPA降解，其中包括两种鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas-1 及Sphingomonas-2 (Sph-2)，一种假单胞杆菌（Pseudomonas）及一种极小单胞菌（Pusillimonas）（图3）。
图3. Binning获得优势物种的基因组，百分数代表16S基因测序物种丰度
BPA降解过程可被分为4个阶段： I阶段为接种到未加入BPA前 ；II，III阶段分别为BPA加入后2h和14h；IV阶段为BPA加入24h后。宏转录组数据分析表明有2种主要的表达类型：A型（在第II和第III 阶段上调表达，在第IV阶段不表达或下调表达）和U型（在第II和第III 阶段不表达或下调表达，在第IV阶段上调表达）。功能预测的结果显示Sph-1和Sph-2菌包含转化BPA为一级代谢产物的基因以及编码细胞色素P450酶（CYP）的基因，与之前研究的Sphingomonas sp. AO1菌的编码CYP的基因具有99%的相似性，与编码铁氧化还原蛋白的基因具有100%的相似性。同时包含将4-羟基苯甲酸 (4-HBZ) 转化为草酰乙酸/丙酮酸，将4-羟基苯乙酮（4-HAP）转化为4-乙酰氧基苯酚（4-HPAT）（图4）。而负责转化4-羟基苯乙酮（4-HPAH）和4-HPAT的基因只存在有Sph-1中。在Sph-1和Sph-2中编码CYP和铁氧化还原蛋白的基因，以及编码转化4-HBZ和三羧酸循环（TCA）的基因均呈现A型表达；相反负责转化4-HAP为对苯二酚（HQN）的基因hapA和hapB都为U型表达。说明Sph-1和Sph-2在群落中主要负责BPA降解的细菌。
图4. 涉及BPA降解过程的基因表达以及细菌代谢关系
Pseudomonas 和 Pusillimonas细菌不含有任何初始化降解BPA的基因，却拥有完整或近完整转化4-羟基苯甲醛（4-HBD）到琥珀酰辅酶A（succinyl-CoA）的基因和编码4-HBZ膜转运蛋白的基因，其基因表达谱呈现整个代谢途径具备A型表达特征。Pseudomonas同时含有转化4-HAP到3-氧代乙二酸（3-ODP）的完整通路，但其表达谱为U型表达。在Pusillimonas菌中的编码4-HAP降解下游途径（HQN转化为succinyl-CoA）在IV阶段为上调表达，提示在最后阶段Pusillimonas参与了4-HAP的降解。研究结果还提示该群落中4-HBZ的降解为混合的代谢途径。
以上综合分析提出假设：2种Sphingomonas菌负责主要的初始BPA降解，将BPA转化为包括4-HBZ及4-HAP在内的中间产物。虽Sphingomonas会并进一步将4-HBZ及4-HAP在内的中间产物进行矿化，但菌群中其他主要微生物类群，如Pseudomonas及Pusillimonas等，因可利用BPA代谢的中间产物，且可能具备更强的代谢速度，而与Sphingomonas构成了一个既互利又竞争的微生物群落。
三 细菌分离验证BPA降解环境中细菌相互关系
使用包含BPA和非选择性培养基分离Sphingomonas sp.和Pseudomonas sp.。基因组草图分析与宏基因组数据分离的基因组具有100±0.48%（Sph-2）和100±0.04%的相似性。在批次实验中，Sph-2单独培养的环境中，积累表明Sph-2对BPA及诸多初级代谢产物，如1-BP、4-DM的降解是高效的，而对2,4-BP, 3,4-BP 和 4-HPAT的降解是低效的。相反，相较于Sph-2, *Pseudomonas sp.*可更为高效的利用4-HBZ、4-HBD、4-HAP和4-HPAT等中间产物。这些结果与多维宏组学获得的基因功能预测结果相符。
当将Sph-2和Pseudomonas sp.混合培养（co-culture）时，BPA的降解速率明显快于Sph-2单独培养的的速率。见图5c，24h后混合培养下TOC的降低了69±0.5%，而单独Sph-2时之降低了40±0.6%。72h后分别降低84 ± 0.4% 和 77 ± 0.4%。在24h内TOC的快速降解，与1-BP、4-DM、4-HBD、4-HBZ、4-HAP和 4-HPAT的降解相关。在混合培养中，并未检测到4-DM、4-HBZ和4-HPAT，很大程度是由于Sph-2对4-DM的快速消耗，以及**Pseudomonas sp.**对4-DM下游代谢的的降解。同时，Sph-2和Pseudomonas sp. 在24h内均快速增长，Sph-2在单菌培养和与**Pseudomonas sp.混合培养在72h内增长量相似（图5d），表明Pseudomonas sp.**消耗了BPA的降解产物，且并未对Sph-2的生长产生影响。
*图5. Sph-2无菌培养(a)和与*Pseudomonas sp.混合培养(b)的BPA降解、TOC降低(e)和细菌增长(d)
总结
本研究提供了有效的证据支撑在BPA降解的富集群落中菌间存在的物质交换，并解析其BPA降解体系中菌间相互作用。**Sphingomonas sp.可以在维持足够4-HBD和4-HBZ满足自身生长需求，但其降解效率低于群落中的其他细菌。而当Pseudomonas sp.存在时，可以同时降解4-HBD、4-HBZ和4-HAP，这一过程加速了Sphingomonas sp.**对BPA的初始降解。另一方面，**Pusillimonas sp.**还参与对4-HAP的下游代谢产物的降解，可进一步提高整个群落对BPA的矿化效率（图6）。
该研究表明尽管负责目标代谢物降解过程的微生物非常重要，但是涉及降解其代谢产物的微生物对于整个降解过程同样有至关重要的促进作用。因此，代谢合作关系比单一的微生物降解更加有利。
在BPA降解混合微生物环境中，LC-MS/MS不能检测到完整的代谢产物，但将宏组学分析作为补充，可以对复杂的混合生物关系有更加充分的了解。该研究证明了综合利用宏组学分析可以有效的揭示在群落水平和个体水平的代谢能力和竞争合作关系，多维宏组学与环境依赖型实验可以有效的揭示阐释影响降解表现的相互关系。
图6. BPA混合降解关系简图
作者简介
张彤，香港大学土木工程系教授，香港大学公共卫生学院荣誉教授， 南方科技大学环境科学与工程学院长期访问杰出教授。长期从事污水生物处理和环境工程微生物组的科研工作，研究领域包括生物脱氮除磷，新兴污染物的生物降解，污水中抗生素抗性基因及致病菌检测等。张彤教授实验室在环境分子生物学技术和宏基因组学技术等方面积累了丰富经验。在The ISME Journal，Microbiome，Environmental Science & Technology，Water Research， Bioinformatics等学术期刊上发表相关学术论文200余篇，其中ESI高被引论文16篇，H指数68 (Google Scholar)，总引用14000次（Google Scholar），并于2018年获选科睿唯安（（Clarivate Analytics）全球“高被引科学家”。
余珂，北京大学深圳研究生院环境与能源学院助理教授。主要研究领域包括厌氧菌群、极端环境微生物菌群、肠道微生物菌间互作关系研究及多维宏组学生物信息学方法学构建等。余珂博士在博士期间受教于张彤教授，曾在生物信息学、分子生物学、环境分析化学及环境毒理学等多个领域的杂志，包括Microbiome，Environmental Science & Technology， AnalyticaChimicaActa，Toxicological Sciences等学术期刊上发表相关学术论文30余篇。
Reference
文章主页：https://microbiomejournal.biomedcentral.com/articles/10.1186/s40168-019-0634-5
引文：Yu K, Yi S, Li B, Guo F, Peng X, Wang Z, Wu Y, Alvarez-Cohen L, Zhang T. An integrated meta-omics approach reveals substrates involved in synergistic interactions in a bisphenol A (BPA)-degrading microbial community. Microbiome. 2019;7:16.
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学习扩增子、宏基因组科研思路和分析实战，关注“宏基因组”
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