导读
睡眠剥夺(SD)扰乱了全球数百万人的生活，并深刻地影响了认知和身体机能。患有急性SD的人患阿尔茨海默病和心血管疾病的风险增加，全身炎症水平增加。SD影响全身，涉及多个组织的系统性损害。然而，SD导致认知损害的潜在机制仍不清楚。
2023年1月31日，中国农业大学动物医学院陈耀星教授团队在微生物领域国际知名期刊《Microbiome》（IF：16.8，中科院1区TOP期刊）上发表了题为“Gut microbiota-derived metabolites mediate the neuroprotective effect of melatonin in cognitive impairment induced by sleep deprivation（“肠道菌群及其代谢物介导褪黑激素对睡眠剥夺诱导认知障碍的神经保护作用）”的研究论文。该论文通过菌群移植实验、气单胞菌定植和LPS或丁酸盐补充试验,评估了肠道菌群及其代谢物在褪黑激素改善睡眠剥夺小鼠认知损伤中的介导作用，揭示了褪黑激素（Mel）改善睡眠剥夺诱导机体认知障碍的作用及机制。百迈客为该研究提供了全长微生物多样性测序和非靶代谢组检测服务。
材料方法
材料：雄性 ICR 小鼠，BV2细胞系、收集小鼠粪便、结肠内容物、海马组织
方法：结肠内容物全长16s rDNA测序，非靶代谢组检测，SCFA检测，海马Western blot、ELISA、qPCR
实验设计：菌群移植、气单胞菌定植、LPS补充、丁酸盐补充试验
图1.实验模型的示意图和时间表。
A:粪便微生物群移植 (FMT) 实验。B:Aeromonas veronii 定值实验。
C: LPS（脂多糖）处理实验。D 丁酸盐处理实验。
Mel：褪黑激素，MWM：Morris 水迷宫，载体：2% 乙醇无菌盐水。SD：睡眠剥夺，TAK-242：TLR4抑制剂
研究技术路线
主要结果
1、肠道菌群介导褪黑激素对 SD 诱导的神经炎症和记忆障碍的神经保护作用
为了测试 Mel（褪黑激素）对 SD 引起的记忆障碍的神经保护作用是否取决于肠道微生物群，进行了粪菌移植实验（FMT）。将 CON、SD 或 SD + Mel 组的粪菌移植到肠道微生物群耗尽的小鼠 2 周（图2A）。添加抗生素后，小鼠粪便中的细菌大量减少（图1B）。行为结果表明，SD-FMT 组小鼠到达平台的潜伏期比 CON-FMT 组高 115.8% ，而在第一次测试（使用隐藏平台）中路径长度长 143.3%（图 1C，E-F）。各组之间的路径效率没有显着差异（图2G）。在没有隐藏平台的第二个测试中，SD-FMT 组进入目标区域的次数比 CON-FMT 组低 55.2% ，而花费的时间降低36.4% ，SD + Mel-FMT 和 CON-FMT 组之间没有显着差异（图2D、H、I）。与 SD 供体相比，携带 SD + Mel 供体微生物群的小鼠记忆障碍有所改善，这表明肠道微生物群可能有助于 Mel 赋予 SD 小鼠认知功能障碍的益处（图2C-I）。
为了研究SD介导的肠道菌群是否诱导神经炎症，进一步评估了海马区炎症因子和小胶质细胞免疫组织化学染色的变化。SD-FMT组大鼠海马 CA1、CA3 和齿状回 (DG) 区域 Iba1 阳性细胞的累计光密度（IOD)分别比Con-FMT组高51.9%、27.6%和32.3%。观察到SD-FMT小鼠海马区IL-6和TNF-α水平显著升高，而IL-4和IL-10水平显著降低)。而“SD+MEL微生物群”的FMT显著抑制小胶质细胞的激活，增加促炎因子，降低抗炎因子。进一步通过免疫印迹法检测了cleaved caspase-3、Bax和Bcl-2的表达水平。与CON-FMT组相比，SD-FMT组Bc l-2表达显著下调，cleaved caspase-3表达显著上调，bax表达显著上调。然而，“SD+MEL微生物群”的FMT逆转了这些变化。FMT实验表明，Mel对SD诱导的神经炎症、细胞凋亡和记忆障碍的保护作用需要肠道菌群。
图2.肠道微生物群介导褪黑激素对睡眠剥夺引起的记忆障碍的神经保护作用
2、FMT处理对受体小鼠肠道菌群组成的影响
为了验证FMT是否调节肠道菌群，进行了全长16S rDNA基因测序，以分析受体小鼠FMT的细菌分类组成。共从三组小鼠(n=7)中获得21个样本，并随后对其进行测序以生成V1-V9 16S rRNA基因图谱。结果表明，三组间CHO1、ACE、Simpson和Shannon指数差异无统计学意义。PCoA分析表明，PC1、PC2和PC3分别解释了17.96%、15.50%和9.66%的差异。
图3.FMT处理的小鼠结肠微生物群的组成
LEfSe分析表明，拟杆菌和变形菌在 SD-FMT 组中比在 CON-FMT 和 SD + Mel-FMT组中更丰富。此外，与 CON-FMT 和 SD + Mel-FMT 组相比，SD-FMT 组的厚壁菌门减少 。运用LEfSe分析在三组中确定了 64 个分类群生物标志物。SD-FMT组lachnospiraceae_NK4A136_group、Eubacteriumxylanophilum_group、Ruminococcus_1 和Lachnospiraceae_A2的相对丰度显著低于CON-FMT组和SD + Mel+FMT组，SD-FMT 组中Turicimonas的相对丰度显着高于CON-FMT 和 SD + Mel-FMT 组，而在CON-FMT 和 SD + Mel-FMT 组之间无显着差异。
图4.FMT 处理的小鼠结肠微生物群的组成和关键微生物群。
3、FMT处理对受体小鼠肠道菌群代谢产物组成的影响
进一步对FMT受体小鼠进行了代谢谱分析。对代谢物的分析显示，结肠中有2260种代谢物。维恩图表明，不同的处理导致不同的代谢物变化(图5A)。主成分分析表明，所有组的微生物群代谢物组成都有明显的聚集性，比SD-FMT组更接近CON-FMT组(图5B)。为了进一步验证不同组别样本之间的差异，进行了OPLS-DA分析，OPLS-DA模型显示三组间有较好的分离。火山图展示了差异代谢物上调和下调(p<0.05，|log2FC|>1)(图4E-G)。与CON-FMT组相比，SD-FMT组有547种代谢物上调，15种代谢物下调。与SD-FMT组相比，SD+MEL-FMT组有574种代谢物增加，26种代谢物减少。此外筛选出了三组中变化最大的41种代谢物(图5J)。与SD-FMT组相比，SD+Mel-FMT组丁酸（butyric acid）和L-色氨酸（ L-tryptophan）含量显著升高。
图5.FMT 处理的小鼠结肠微生物群代谢物的组成
4、微生物组组成与表型变量的相关性
为了进一步研究代谢产物是否发生改变，运用用GC/MS测定了粪便中短链脂肪酸的含量。结果表明，SD-FMT组的粪便丁酸含量显著低于Con-FMT组。与SD-FMT组相比，SD+MEL-FMT组的丁酸含量显著增加。运用RT-PCR法测定了结肠中气单胞菌的相对丰度，用ELISA法测定了海马区的LPS水平。SD-FMT组的脂多糖和气单胞菌明显高于Con-FMT组。SD+MEL-FMT组较SD-FMT组显著降低。
相关分析表明，气单胞菌的相对丰度与LPS水平呈正相关。粪便中丁酸含量与微生物g_lachnospiraceae_NK4A136_group、g_eubia_xylanophilum、g_lachnospiraceae_A2和s_CIEAF020呈正相关，与g_Turicimonas和s_Turicimonas_Muris呈负相关。这些发现表明，这些微生物的变化可能与粪便丁酸盐水平的变化有关(图6A)。微生物g_Lachnospiraceae_NK4A136_group与到达平台的潜伏期、到达平台的路径长度、肿瘤坏死因子-α、IL-6和脂多糖呈负相关，与进入靶区的时间、条目数和IL-10呈正相关。因此，SD或Mel处理组肠道微生物介导性作用可能与其调节微生物代谢产物(LPS和丁酸盐)的潜能有关。
图6.微生物组组成与表型变量之间的相关性。
5、褪黑素减轻A. veronii定植所致小鼠神经炎症和记忆障碍的发生
为了验证气单胞菌（Aeromonas）水平升高在SD引起的记忆障碍中的作用，研究者构建了气单胞菌定植小鼠模型(图7A)。在Veronii定植后，观察到小鼠到达平台的潜伏期和路径长度增加，而在小鼠靶区的时间和条目数量。此外，Aero组大鼠海马CA1、CA3和DG区 Iba1阳性细胞的累积吸光度分别比CON组高23.1%、23.9%和22.4%。与CON组相比，AERO组大鼠海马LPS、IL-6和肿瘤坏死因子-α水平显著升高，IL-4和IL-10水平显著降低，TLR4的表达水平升高。Aero组与CON组比较有显著差异。然而，补充Mel抑制了这一过程，导致CON和A+Mel组之间无显著差异。
图7.褪黑激素改善气单胞菌定植诱导的小鼠神经炎症和记忆障碍的发生。
6、丁酸盐对褪黑激素的作用改善 SD 小鼠的记忆障碍
为了研究丁酸盐是否可以介导由 Mel 引起的改善的SD诱导的认知障碍，观察了CON、SD、SD + Abs、SD + Mel、SD + Abs + Mel 和 SD + Abs +丁酸盐组小鼠研在隐藏或可见平台时MWM（Morris水迷宫）试验中的变化（图8A）。与CON组相比，SD组和SD+Abs组小鼠空间记忆障碍明显。后两组显示到达平台的路径长度和延迟显着增加，花费的时间和目标区域的条目数量显着减少。相比之下，Mel 补充剂逆转了 SD 引起的空间记忆障碍变化；在 SD + Mel、SD + Abs + Mel 和 CON 组之间，在到达平台的路径长度和延迟、花费的时间以及目标区域中的条目数量方面没有观察到显着差异。与 Mel 补充剂类似，丁酸盐补充剂可改善 SD 诱导的认知障碍。SD + Abs +丁酸盐和 CON 组之间的任何参数均未观察到差异（图8B-H）。此外，各组之间的路径效率没有显着差异。因此，丁酸盐处理实验的结果表明，丁酸盐作为肠道微生物群的信号分子，可能介导了 Mel 对 SD 引起的认知障碍的改善。
为了研究丁酸盐是否可以介导由 Mel 引起的 SD 诱导的神经炎症和细胞凋亡的改善，检测了 Iba1 表达的变化以及海马中炎性细胞因子和细胞内信号蛋白的释放。与 CON 组相比，SD 和 SD + Abs 组的神经炎症明显，这表明海马 CA1、CA3 和 DG 中 Iba1阳性细胞的 IOD 显着增加，IL-6 和 TNF-α 水平以及 IL-4 和 IL-10 水平显着降低。与 CON 组相比，SD 和 SD + Abs 组细胞内信号蛋白HDAC3、p-IκB、p-P65和 cleaved caspase-3的表达显著上调；相反，Mel 补充剂逆转了 SD 引起的神经炎症和细胞凋亡的变化。上述指标表明SD + Mel、SD + Abs + Mel 和 CON 组之间没有显着差异。与补充 Mel 类似，补充丁酸盐也改善了 SD 诱导的神经炎症和细胞凋亡。SD + Abs +丁酸盐和 CON 组之间的任何参数均未观察到差异。
图8.褪黑素改善脂多糖诱导的小鼠神经炎症和记忆障碍
7、丁酸盐对LPS诱导的BV2细胞炎症反应和细胞神经毒性的影响
为了探讨LPS或丁酸盐代谢产物在SD引起的Mel所致认知功能障碍中的作用，用LPS模拟神经炎症，并以丁酸盐作为干预。正如预期的那样，BV2细胞暴露于LPS后导致肿瘤TNF-α和IL-6分泌增加，IL-4和IL-10分泌减少。经LPS处理后， BV2细胞中HDAC3、p-iκB和p-p65蛋白表达水平升高。
此外，使用小胶质细胞条件培养液(CM)系统来评估丁酸盐减轻小胶质细胞神经毒性是否与神经细胞的存活有关。将从LPS诱导的BV2小胶质细胞中提取的CM加入HT22细胞中，加入丁酸或不加入丁酸处理。脂多糖诱导的CM通过上调cleaved caspase-3水平刺激HT22细胞凋亡。然而，丁酸有效地逆转了这些由LPS引起的改变。相反，在TAK242处理后，与LPS组比较，HDAC3，p-iκB和p-p65蛋白下调。结果表明，LPS+丁酸盐+AZD3965处理组与LPS处理组相比，AZD3965对MCT1的抑制导致HDAC3，p-iκB和p-p65蛋白的表达上调。此外，与LPS+丁酸盐组相比，经ITSA-1作为HDAC3激动剂处理后，p-IκB和p-p65蛋白表达上调，对HDAC3蛋白表达水平无明显影响。然而，使用pDTC(NF-κB拮抗剂)的治疗与丁酸盐的有益效果相似。
图9.丁酸改善睡眠剥夺小鼠记忆障碍的实验研究
总 结
该研究揭示了Mel对SD所致的认知损害的保护作用。进一步的机制研究表明，气单胞菌(Aeromonas)和脂多糖（LPS)水平的下调以及LachnospiraceaeNK4A136和丁酸水平的上调可能是Mel在SD引起的认知障碍中发挥神经保护作用的潜在机制。
参考文献
Wang X, Wang Z, Cao J, Dong Y, Chen Y. Gut microbiota-derived metabolites mediate the neuroprotective effect of melatonin in cognitive impairment induced by sleep deprivation. Microbiome. 2023;11(1):17. Published 2023 Jan 31. doi:10.1186/s40168-022-01452-3
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