做扩增子测序你一定纠结过我到底测细菌的哪个区呢，V3+V4，或者V4+V5？
细菌的16S全长一共有V1-V9九个区不管选一个区还是两个区，我们在进行物种注释时都无法将其准确注释到物种水平而仅仅是属水平。这也与目前最为广泛所有的Illumina技术特点有关，尽管其不断发展可以扩大其测序的通量，但其进行测序反应时必须让每个DNA站立结合在Flow cell 上的每个Index上，如果每个DNA长度太长会使得不同的DNA模板交联结合在一起从而使得测序反应无法进行下去。
目前Pacific Biosciences 公司的PacBio RS II 平台以及Sequel平台是真正成熟的商用第三代测序仪。但是尽管PacBio测序的错误率还很高，但是其超长的测序片段（官方数据最长15Kb）让其在全基因组组装，微生物宏基因组测序等方面具有其它平台无法比拟的优势。之前有些文献报道了用三代Pacbio进行细菌16S全长测序。文章用Ex Taq DNA polymerase 酶选取了27F和1492R引物对细菌16s全长进行了测序。
而作为微生物的重要组成部分真菌也开始了用三代测序仪进行宏基因组测序了。在第二代高通量测序中由于其双端读长小于500bp。所以这只能给真菌的分类与系统发育分析提供很有限的物种鉴定和分类信息。微生物物种水平的鉴定与功能注释是微生物组学以及生态学研究的核心目标之一,而三代测序能很好的解决目前这个痛点。目前由于价格昂贵的原因，用PacBio来进行真菌扩增子测序，文章还非常的少，未来随着测序通量的提高以及价格的下降，将会得到更广泛的应用。