其它作者：Mattias de Hollander¹, Daniel Ruiz-Buck¹ Lucas W. Mendes⁵, Wilfred F.J. van Ijcken⁶,
Ruth Gomez-Exposito⁷, Somayah S. Elsayed², Prarthana Mohanraju⁷, Adini Arifah⁷,
John van der Oost⁷, Joseph N. Paulson⁸, Rodrigo Mendes⁹, Gilles P. van Wezel^1,2

作者单位：

¹ 荷兰，瓦赫宁根生态研究所，微生物生态中心（Department of Microbial Ecology, Netherlands Institute of Ecology (NIOO-KNAW), Droevendaalsesteeg 10, 6708 PB
Wageningen, Netherlands）

² 荷兰莱顿大学，生物研究所(Institute of Biology, Leiden
University, Sylviusweg 72, 2333 BE Leiden, Netherlands)

³ 哥伦比亚共和国，安蒂奥基亚大学（PECET, University of Antioquia, Medellín, Antioquia 050010, Colombia）

⁴ 荷兰，瓦赫宁根大学，生信中心(Bioinformatics Group, Wageningen University, Droevendaalsesteeg 1, 6708 PB Wageningen, Netherlands)

⁵ 巴西，圣保罗大学（Cell and Molecular Biology Laboratory, Center for Nuclear Energy in Agriculture (CENA), University of Sao Paulo (USP), Piracicaba, Brazil）

⁶ 荷兰，鹿特丹伊拉斯姆斯大学(Erasmus MC, University Medical Center Rotterdam, Department of Cell Biology, Center for Biomics,
3025 CN Rotterdam, Netherlands)

译者有话说

抑病型土壤的研究主要集中在特异性抑病土壤上，目前已经有很多高水平文章解析过抑病型微生物群落，这篇Science无疑是最新和最全的一篇。从内容上来，描述了抑病型土壤的群落结构和功能；得到了候选功能菌株，并通过培养组得到了大量的分离株，并开展菌株功能验证；而后进行功能基因的筛选，敲除和验证，最终形成了一个完美的故事。确实是本领域研究的学习模板，并值得我们重现这篇文章的分析过程。

这篇文章关注的是抑病型微生物群落的解析，对于抑病型微生物群落的形成也十分重要，那么内生菌群是如何被植物招募并进入根系内部的呢？是否根系分泌物在这个过程中也起着重要作用？相信这将是很有意思的故事。

摘要

一些土壤显示出显著的抑制植物病原体引起疾病的能力，这种能力归因于与植物相关的微生物群。 Carrión等研究枯萎真菌茄枯萎病菌感染甜菜，内生菌（在根中发现的亲密微生物群落）在真菌疾病抑制中的作用。转录分析表明，几种细菌内生菌种会激活生物合成基因簇，从而抑制疾病。这些生物产生抗真菌效应物，包括可消化真菌细胞壁的酶，以及次生代谢产物，包括吩嗪，聚酮化合物和铁载体，可能有助于抗真菌表型。

生活在植物内部的微生物可以促进植物的生长和健康，但是它们的基因组和功能多样性仍然难以捉摸。在这里，宏基因组学和网络推论表明，植物根部的真菌感染在根内富集了几丁质菊科和黄杆菌科，以及几丁质酶基因和编码未知核糖体肽合成酶（nonribosomal peptide synthetases，NRPSs）和聚酮化合物合酶（polyketide synthases，PKSs）的各种未知的生物合成基因簇。菌株级别合成的几丁质和黄杆菌的菌群，以持续抑制真菌根部疾病。然后定点诱变表明，以前未鉴定的黄杆菌中的NRPS-PKS基因簇对于内生菌群抑制疾病至关重要。我们的研究结果表明，内生根微生物群具有许多尚不为人所知的功能性状，可以共同保护植物内外。

前言

植物微生物组研究已经积累了大量的测序数据和丰富的信息，表明了许多植物根际、叶际、种子和胚层中不同微生物群落的多样性和丰富度。然而，迄今为止，很少有研究论证微生物菌群对特定植物表型（即植物生长、发育和健康）的影响。因此，在分子和化学层面上许多植物表型与微生物群结构和功能之间在的因果关系仍然未知。本研究旨在探讨植物内生微生物菌群的基因多样性及对真菌感染植株的保护作用。为此，我们整合了包括网络推断和宏基因组学在内的多种方法，以寻找可以抑制Rhizoctonia solani枯萎病（水稻、小麦和甜菜等几种植物根部的真菌病原菌）的内生菌菌群体和功能基因簇。

抑病土壤是一种特殊的生态系统，在这里，由于微生物群落的保护作用，植物才得以存活。各种类型的抑制性土壤都相继报道过，包括真菌、细菌、卵菌和线虫的抑病土壤。抑病性可以通过加热消失，也可以移植到没有抑病作用的土壤中，类似于人类的粪菌移植。

在田间土壤中，通过感病作物的连续栽培过程中集中爆发病害来诱导土壤对病原菌（例如：R.solani）的特异性抑制作用（类似于人类的疫苗）。一旦抑病性形成，如果种植非寄主植物时，这种抑制不表现；但在寄主植物和特定真菌病原体的存在下，抑病作用重新唤醒。这种特异性抑病性土壤一旦形成，便保护之后种植的同种作物和对病原菌产生抵抗性，但是抑病性却在种植其他作物时不表现。

因此，病原菌、寄主植物及其根际微生物群之间的相互作用是特异性抑病性产生和持续的关键因素。我们以前的研究表明，对病原菌 R.solani 有抑制作用的土壤中，发现甜菜根际的几个细菌属paraurkholderia、假单胞菌（pseudomonas）和链霉菌（streptomyces）起着重要的作用。

为了了解那些生活在植物根组织中的微生物（内生菌）在抑病性产生过程中发挥的作用，我们对生长在抑病土壤中的甜菜幼苗的根内进行了宏基因组测序分析；并鉴定了与抑病相关的微生物群落和功能组成；以区分哪些生物合成基因簇（BGCs）在感染过程中上调，然后重组内生菌群；最后进行位点定向突变，检测特异性BGCs是否在抑病过程中起着重要作用。

主要结果

内生菌群落多样性和网络分析

Taxonomic diversity and network inference of the endophytic microbiome

附图1展示了研究设计：设置甜菜种植在发病(Conducive, C)和抑病土(Suppressive, S)壤和是否接种病原菌R. solani（R）共计四个处理。在抑病土壤中接种病原菌(S+R)的甜菜发病率为15-30%，在感病土壤中接种病原菌(C+R)的甜菜发病率为80%(附图1A)。

附图1. 本研究实验设计示意图

因为发病率过高导致没有足够的根系材料用于深入的微生物组学分析。因此我们最终只收集了处理：C，S，和S+R的材料用于下一步测序和生物信息学分析见附图2和附表1/2。

附图2. 内生菌群宏基因组分析流程

宏基因组测序结果显示这里有76.1%的序列注释为细菌，10.5%的序列注释为真菌，0.0065%的序列被注释为古细菌(附图3A/B)。

附图3. 质控后数据基因注释的比例

对于真菌序列有监督的cpcoa分析表明内生真菌在三组之间存在显著差异（(PERMANOVA), P < 0.05]）(附图4A)。这是由于在S+R组大量接种了病原真菌R. solani导致的(附图4B/C)。

附图4. 宏基因组中提取的真菌序列整体分析

A. CSS标准化下的bray-curtis距离；B. 三元图展示真菌读长数量；C. 柱状图展示丝核菌属 Rhizoctonia 的相对丰度

而且其他两组并没有准确注释到真菌的微生物门类。因此，这一结果表明在抑病土壤中接种的R. solani会定殖到甜菜根系，但是却不会发病。

从宏基因组数据中提取16S核糖体保守序列用于注释病评估内生菌细菌群落。结果表明变形菌门和酸杆菌门主导了内生菌细菌群落。这两个菌门中得到的10个OTU均在S+R中显著富集：Pseudomonadaceae
(两个), Xanthomonadaceae (四个）,
Chitinophagaceae (一个), Flavobacteriaceae
(两个), 和 Veillonellaceae (一个) (附图5)。

附图5. 甜菜内生菌微生物组的多样性

A. CAP（Constrained Analysis of Principal Coordinates）分析展示Beta多样性(可解释23%的总体差异)；conducive soil ©, suppressive soil (S) or suppressive inoculated with R. solani (S+R).

B-D展示门、纲、科水平各组中的相对丰度，其中D图上展示香农多样性指数且无显著差异；

共线性网络分析表明S+R组内生微生物群落复杂度更高**(附表3).相关研究也表明连接性比较高的网络往往出现在微生物群落面对逆境的时候，比如病原菌入侵**。有意思的是在S+R网络中80%的连接点都属于Chitinophaga, Flavobacterium和 Pseudomonas这三个科。当将属于Bacteroidetes的序列去除，这三组差异就难以区分。这再次暗示了Bacteroidetes
中的 Chitinophaga和Flavobacterium与抑病相关。

图1. 病原菌改变植物内生菌群落结构和功能

Fig. 1. Pathogen-induced changes in endophytic microbiome diversity and functions.

生长在S和S+R两个土壤中的植物内生不同菌群丰度差异

图1A. 通过宏基因组提取16S rRNA基因序列注释细菌群落并统计不同门类细菌差异，最大的圈代表门水平，逐渐缩小的圈按照梯度分别代表纲，科，属。

图1B. 基于宏基因组序列注释功能和物种相关功能差异。最小的圈代表COG功能单位。圆圈大小代表了不同物种或者功能的平均丰度。S组富集的物种或者功能使用绿色标记，S+R组富集的使用蓝色标记。不显著的物种或者功能使用黄色标记。

图1C. 左边散点图描绘了全部S+R组属于拟杆菌门的全部基因/S组对应基因的丰度比值，右边散点图是S组属于拟杆菌门的全部基因/C组对应基因的丰度比值。散点图从上到下排序顺序按照S+R/S比值。每个COG类别缩写对应如下：C：能量代谢；D：细胞周期，细胞分裂和染色体分区；E：氨基酸运输和代谢；F: 核甘酸转运和代谢；G:碳水化合物的运输和代谢；H:辅酶的运输和代谢；I:脂质的运输与代谢；J:翻译，核糖体结构；K:转录；L:复制，重组和修复；M:细胞壁，细胞膜和细胞被膜的生物发生；O:翻译后修饰，蛋白质转换；P：无机离子的运输和代谢；Q：次生代谢产物的生物合成，转运和分解代谢；T：信号转导机制；U：细胞内运输，分泌和囊泡运输；V：防御机制。

内生菌群落功能多样性

Functional diversity of the endophytic microbiome

从宏基因组测序数据中得到50%-70%的序列都被注释到了功能(附图3C-E)。通过对其他基因的注释显示有56,175条与微生物类群相关的功能，其中402个功能是显著在S组中显著富集的。在S+R组我们发现部分基因上调超过10倍，这些基因属于“碳水化合物转运和代谢”和“信号转导机制“。同时发现与这些基因高度相关的微生物门类均在S+R中显著增加，包括： Chitinophagaceae和Flavobacteriaceae (Bacteroidetes); Pseudomonadaceae和 Xanthomonadaceae (Gammaproteobacteria); Hyphomicrobiaceae和Rhizobiaceae (Alpha-proteobacteria); 和* Burkholderiaceae* (Betaproteobacteria) (图1B/C, 和附图9A)。

附图9. 内生菌微生物组碳水化合物活性酶的分布和多样性

A. 热图展示各组中显著差异的基因，按物种来源注释分类

B. 碳水化合物代谢相关的HMM结构域与基因间的相似网络

其中大部分增加的基因(3138/4443) 被注释为与Chitinophagaceae 和Flavobacteriaceae (图1B和附图9A)相关。当我们选择更严格的阈值定义上调基因时，发现有461个上调基因，这些基因大部分都与Chitinophagaceae 和Flavobacteriaceae相关。仅对Bacteroidetes相关的基因做差异分析，显示了S+R组和S组间按COG功能注释为Q类（次级代谢产物生物合成、转运和分解代谢）的基因差异最大；而S组和C组之间G类（碳水化合物转运和代谢）基因的差异最大(图1C)**。

为了更详细的了解COG的G类和Q类功能的细节，我们分别查找了碳水化合物活性酶数据库（CAZymes）和次级代谢产物生物合成基因簇数据库antiSMASH。通过dbCAN, 我们注释得到1822个基因主要属于一下功能分类模块：糖苷羟化酶、糖基转移酶、多糖裂解酶和糖酯酶结构域以及非催化性糖结合模块。

因为这些结构域与进化相关并且参与相关功能，所以我们使用 hhsearch 算法计算蛋白保守结构域的相似性。从而发现按S+R组内生菌群中有更多的糖苷水解酶和糖基转移酶与抑病相关(图2A和附图9B/C) 。与S组相比，S+R组有三类内生菌在CAZyme酶注释上显著不同 (FDR < 0.1; 图2A和附图9A/B)。此外，我们发现Chitinophagaceae含有一些与真菌细胞壁降解的相关酶类。比如：几丁质酶、β-葡聚糖酶和内葡聚糖酶等。注释为Burkholderiaceae 和Xanthomonadaceae科**(附图9B/C)**的菌有两个几丁质酶结构域和三个参与几丁质降解的蛋白酶。这五个结构域在这三种菌是共有的。表明了这些富集的内生菌在同一种功能上的冗余。细菌基因组中包含了大量的BGCs，但是大部分都没有备注到已有的模块和功能。通过antiSMASH分析次级代谢表明730个生物合成基因簇(BGCs)与非核糖体肽、聚酮、萜类、芳基多烯、核糖体合成和翻译后修饰肽（RIPS），膦酸盐、吩嗪和铁载体相关。在这些730个BGCs中已经有12个在先前的研究中报道过，并且物质化学结构也被阐明(附图11和附表5)。

附图11. 内生菌微生物组中已知生物合成基因簇的分布

其中包括两个脂肽类抗生素thanamycin和 brabantamide，并且相关产品也用在土壤中来抑制病原菌Rhizoctonia。其他718个BGCs注释目前还不够成熟，其中117个BGCs显著在S+R组中过表达并且其中34个BGCs属于Bacteroidetes (图3A-F和附图10-12)。值得注意的是这34个BGCs中并不包括先前已经在根际鉴定过的thanamycin和brabantamide。在这过表达的117个基因中有10个NRPS基因簇属于Bacteroidetes菌，并且通过antiSMASH 数据库发现这些都和MIBiG中注释到的基因簇不匹配。

图2. 内生菌群碳水化合物相关活性酶的多样性和分布

Fig. 2. Diversity and distribution of carbohydrate-active enzymes in the endophytic microbiome.

图2A. 与碳水化合物酶类相关的已知蛋白和预测蛋白结构域的相似性网络。使用网络展示不同蛋白结构域之间的距离和相关性。使用CAZymes对生长在抑病土壤S组或接种病原菌的抑病土壤S+R组的植物内生菌群中注释，一共得到1822个基因。节点分为五大类：糖苷水解酶（GH，蓝色）；糖基转移酶（GT，橙色）；多糖裂解酶（PL，紫色）；糖脂酶（CE，绿色）和非催化碳水化合物结合模块（CBM，红色）。位置结构域或者功能尚未验证的蛋白结构域标记为黄色。方形节点代表物种注释为Chitinophagaceae的相关酶在S+R组中显著高于S组。在S+R中过表达的并在分类学水平上属于Burkholderiaceae和Xanthomonadaceae的相关酶类展示在附图9 B/C**中。

图2B. 展示标记的三种富集在S+R组的科水平细菌的CAZymes注释数量。韦恩图黄色代表Burkholderiaceae (黄)；蓝色代表 Chitinophagaceae (蓝)；绿色代表Xanthomonadaceae (绿)。韦恩图标记了每个酶对应Pfam数据库ID。韦恩图展示和每个物种共有的和特有的相关结构域数量。

从头组装内生菌基因组

De novo assembly of endophytic bacterial genomes

从antiSMASH数据库中鉴定得到的730个BGCs中，有157个包含在组装成的25个基因组 (MAGs)中**(附图13/14和附表6)**。

附图13. 内生菌微生物组宏基因组数据分箱

A. 重叠群GC含量与覆盖度的散点图；B. 不同分箱软件结果进行ChechM评估完整性和污染率；C. 重叠群和分箱的长度累计；D. 重叠群的大小和覆盖度样式

附图14. 内生菌的宏基因组分箱与参考基因组比较

A. PCoA展示MAGs和参考基因组中的功能距离；B/C分别代表变形菌门和拟杆菌门类似的分析。

随后根据这些BGCs，我们设计相应的特异性引物来匹配我们分离出来的纯菌。先前我们一共分离得到935个菌株，并使用16S rRNA基因测序鉴定**(附图15A/B, 和附表7)**。

附图15. 分离内生菌株的物种多样性

A. 属水平内生菌物种组成。B. 培养的937个菌株；C. 拟杆菌门7个测序的基因组、与121已知菌和25个分箱的进化关系。

结果一共有八个不同的属，大部分菌株属于
Bacteroidetes和Gammaproteobacteria。尽管通过PCR，并没有发现BGCs和属于Chitinophaga和 Pseudomonas的菌株之间的联系，但是发现有四个BGCs(BGC298, BGC396, BGC471, and BGC592) 在S+R组富集的内生菌Flavobacterium中。这四个BGCs中有三个 (BGC396, BGC471和 BGC592)属于NRPS基因簇，第四个属于PKS基因簇**(BGC298, 图4A)**。类似的方法也发现S+R组中获得的三株Chitinophaga菌含有glycosyl hydrolase (GH18)基因。随后这三个菌株用试验验证了具有降解几丁质的能力。对三株Chitinophaga和四株Flavobacterium（同一个属内具有99%相似度）进行基因组测序 (附图15C和16，附表9)。

附图16. 比较基因组分析测序和宏基因组拼接的Flavobacterium基因组

A. Progressive Mauve对齐Flavobacterium基因组。B. 在四2上基因组中生物合成基因簇的结果；C. 基因预测的功能。

结果表明了这些菌的富集的确造成了相关基因的过表达。对于关键的BGCs，与完整的Bacteroidetes基因组比对没有发现我们分箱的基因组是错配造成的**(附图16B/C, 附图17A-C)**。

附图17. 包含NRPS的生物合成基因簇与MiBIG数据为中已经基因簇的BiG-SCAPE网络

A/B/C分别对应0.3/0.5/0.7一致率的阈值。

图3. 内生菌群落生物合成基因簇的多样性和分布

Fig. 3 Diversity and distribution of biosynthetic gene clusters in the endophytic microbiome.

图3A. 内生菌群中检测到的不同BGCs序列相似性网络（使用BiG-SCAPE构建；阈值选择0.8）。展示节点的物种分类注释和BGC分类注释。在网络中去除少于三条连接的节点（原始网络包含全部的节点附图10）。节点颜色代表基于Welch’s t test检验的显著性(FDR < 0.1)：黄色节点代表不显著；蓝色代表在S+R中显著上调的基因。

图3B. 通过antiSMASH数据库使用Clusterfinder 算法检测到不同处理植物内生菌群过表达的BGCs。

图3C-E. 分别展示变形菌门Proteobacteria ©, 拟杆菌门Bacteroidetes (D) 和末分类unclassified(E)中显著在S+R中富集各类型BGCs的数量（注意：这些BGCs中不包含无法分类的基因）。

图3F. 33个NRPS基因簇的相对丰度聚类热图[使用CSS标准化方法转化RPKM]，与C组相比，这些基因簇在S或S+R组中一致表达。

抑病微生物组的重组和功能分析

Reconstruction and functional analysis of disease-suppressive consortia

我们选择了7株菌进行根际定植并测定特定BGCs的表达量。所有的菌株均定植甜菜幼苗的根际和根内。转录组分析也表明了接种病原菌后根际和内生菌群几丁质酶表达量显著增加**(图4B/C, 和附图20)。对于这四个基因簇，在植物受到病原菌侵染后，BGC298在根内的表达量比根际更高(图4C)。BGC298在四个 Flavobacterium 基因组中都存在并且在MIBiG数据库中没有注释(附图17)**。

综合以上多个证据表明Flavobacterium 和Chitinophaga在抑病过程中起着重要作用。通过实验验证这一假设，三个独立的验证实验表明了Flavobacterium 和Chitinophaga的组合菌群抑病性能最好。为了证实黄杆菌BGC298在抑病过程中的作用，我们开发了一个SpyCas9介导的基因敲除掉系统。我们获得了两个BGC298的突变体，PKS在这两个突变株中缺失，通过单细胞测序进行了验证。通过这两个突变株同野生株进行定殖实验发现抑病性能降低。并且通过突变株重组菌群的抑病效果也降低。

图4. 抑病微生物群转录和功能分析

Fig. 4. Transcriptional and functional analyses of disease-suppressive
consortia.

图4A. 在黄杆菌Flavobacterium MAG nbed44b64 和四株分离的黄杆菌endophytic Flavobacterium中均鉴定到了这四个基因簇：BGC298, BGC396, BGC471和BGC592。图中展示的是NRPS和PKS基因家族编码蛋白的模块类别和保守结构域。结构域和标示如下：C，凝结；A，腺苷酸化；KS，酮合酶；AT，酰基转移酶；PCP，肽载体蛋白；TE，硫酯酶。在GC298中NRPS和PKS基因家族预测底物为甘氨酸、丙二酰辅酶A和甘氨酸。

图4B/C. 通过 Chitinophaga和Flavobacterium 菌株处理甜菜幼苗，使用荧光定量PCR对根际和根内的BGC298, BGC396, BGC471, BGC592和chitinase(GH18) 基因进行表达量的分析。使用 LogRQ进行表达量的展示：低于0表示使用管家基因（glyA）标准化之后下调。柱状图每个柱子为每组重复的均值，黑色线段代表均值的标准差。柱状图上的不同字母代表单因素方差分析和Tukey多重比较后显著的差异。

图4D-F. 使用三株Chitinophaga菌（Ch93, Ch94和 Ch95）和四株Flavobacterium（Fl96, Fl97, Fl98和 Fl5B）单独或者组合验证甜菜发病率，实验表明这些处理菌降低了甜菜枯萎病发病率。

图4D/E. 使用这单独七株菌和七株组合验证发病率。

图4F. 展示敲除了BGC298基因的两种Fl98 突变株 (Fl98-1和Fl98-2)；Ch94和Fl98组合菌群和全部七株组合的发病率。

所添加单菌浓度和混合菌株浓度均为10⁷每克土壤。柱状图每条柱子都是均值，上面展示了标准差的误差线。发病率接种病原菌在21-28天后统计。不同字母表示ANOVA和Tukey HSD检验多重比较后显著的处理。

Reference

Víctor J. Carrión, Juan Perez-Jaramillo, Viviane Cordovez, Vittorio Tracanna, Mattias de Hollander, Daniel Ruiz-Buck, Lucas W. Mendes, Wilfred F.J. van Ijcken, Ruth Gomez-Exposito, Somayah S. Elsayed, Prarthana Mohanraju, Adini Arifah, John van der Oost, Joseph N. Paulson, Rodrigo Mendes, Gilles P. van Wezel, Marnix H. Medema & Jos M. Raaijmakers. Pathogen-induced activation of disease-suppressive functions in the endophytic root microbiome. Science 366, 606-612, doi:10.1126/science.aaw9285 (2019).

https://science.sciencemag.org/content/366/6465/606

译者：文涛南京农业大学

责编：刘永鑫中科院遗传发育所

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