small RNA学习（二）：原始数据去3'端adapter

小RNA测序的数据要多看一下adapter。

图片来源：https://www.plob.org/article/2810.html

拿我下载的数据来看，reads读长是51，但小RNA的长度基本都是20多点（21，24），肯定会把接头序列也测到。所以在很多地方都会强调要去除3'端的接头序列。

那接头序列怎么确定呢？
最好的办法当然是熟悉实验建库测序过程了。不过就这次在GEO上下载的数据来说，我大概能推断出一部分。根据上面的示意图，接头序列的两端是固定的，仅有中间一小部分是可变的，用来区分样本。于是就来看看下载的数据吧。

我看了几个fastq文件，发现每个文件都能看出来reads与reads之间在3'端是有重叠的，这应该就是接头序列的一部分了。

然后在每个fastq文件中，选一个带有很长接头的reads，把接头截出来比较。

SRR1266859  TGGAATTCTCGGGTGCCAAGGAACTCCAGTCAC-CAGATC-A
SRR1266860  TGGAATTCTCGGGTGCCAAGGAACTCCAGTCAC-ACTTGA-ATCTCGTATGCC
SRR1266861  TGGAATTCTCGGGTGCCAAGGAACTCCAGTCAC-ACAGTG-ATC
SRR1266862  TGGAATTCTCGGGTGCCAAGGAACTCCAGTCAC-GCCAAT-ATNT
SRR1266863  TGGAATTCTCGGGTGCCAAGGAACTCCAGTCAC-ATCACG-ATC
SRR1266864  TGGAATTCTCGGGTGCCAAGGAACTCCAGTCAC-CGATGT-ATCTCGTATGCC
SRR1266865  TGGAATTCTCGGGTGCCAAGGAACTCCAGTCAC-TTAGGC-ATCTC
前33个是相同的，然后有6个碱基可变，然后又是相同的

可以看出确实是跟上面的图是吻合的，于是就选择“TGGAATTCTCGGGTGCCAAGGAACTCCAGTCAC”，即前33个碱基作为接头序列，来trim。为什么选一部分接头就够了（而不把后面的取完整），因为trim的时候是将reads上和接头序列比对上的那一部分及其之后的序列全都切掉，所以没必要，还有一个好处是这样可以同时给多个样本trim。

$ cat SE.fa 
>SE
TGGAATTCTCGGGTGCCAAGGAACTCCAGTCAC

for i in `seq 59 70`
do
java -jar trimmomatic-0.36.jar SE -threads 8 -phred33 \
-trimlog log${i} SRR12668${i}.fastq.gz out.SRR12668${i}.fastq.gz \
ILLUMINACLIP:/srna_project/data/SE.fa:2:30:10
done

过滤后就是这样的

$ less out.SRR1266859.fastq.gz | head -n 8
@SRR1266859-1-1
TTGGANTGAAGGGAGCTCCTTC
+
@CCFF#4ADFHHGEEHIJJJJJ
@SRR1266859-2-1
AATATAGATCAAGCGGTTCTAGCT
+
CCCFFFFFHGHHGJGIIIJIJJJJ

下面的图是过滤前后的fastqc检测的报告
过滤之前
Adapter Content

过滤之后
Adapter Content

Per base sequence content，不平行，普遍是这样吗？

Sequence Length Distribution，峰值在24核苷酸处。