Nature Genetics | NLRC4基因变异导致自身炎症并发巨噬细胞活化综合征

炎症的特征

炎症小体（Inflammasomes）是一种由多种蛋白质组成的复合物，其主要作用是识别并响应细胞内或外部的危险信号，如感染、损伤、细胞死亡等。在炎症体的作用下，细胞会产生一系列强效促炎细胞因子，如IL-1β和IL-18等，从而引发炎症反应。IL-1β和IL-18是两种重要的促炎细胞因子，它们能够引发炎症反应，导致组织损伤和疾病发生。

因此，炎症小体可以被看作是一种平台，它将危险信号的识别与强效促炎细胞因子的产生相结合。这种机制可以帮助机体及时响应并清除有害的微生物、细胞残骸等，从而维护身体的健康。然而，当炎症体的调控失衡时，可能会导致过度的炎症反应，进而引发自身免疫性疾病等疾病。因此，对炎症体的研究不仅可以深入理解机体的免疫调节，还能为相关疾病的治疗提供新的思路。通过发现NOD样受体（NLR）NLRP3的显性突变引起了寒冷性自身炎症综合征（CAPS），将NLRP3炎症体的持续激活与人类疾病联系在一起。至少还有两个NLR蛋白被发现直接组装IL-1β/IL-18激活的炎症体，分别为NLRC4和NLRP1，但尚未与单基因疾病相关联。在激活后，这些NLR传感器寡聚并通过同源卡莫互作域（CARD）相互作用使半胱氨酸蛋白酶发生蛋白水解活化。活性半胱氨酸蛋白酶随后切割负责促炎细胞因子活性前体的proIL-1β和proIL-18形成，并通过依赖半胱氨酸蛋白酶但不依赖IL-1β/IL-18诱导细胞死亡。

先前已将两个NLR基因NLRP3和NOD2的显性突变与自身炎症性疾病寒冷性自身炎症综合征（CAPS）和Blau综合征相关联。寒冷性自身炎症综合征（CAPS）的症状包括发热（通常是寒冷诱发的）、中性粒细胞性荨麻疹和炎性听力损失（家族性寒冷诱发自身炎症综合征（FCAS）：MIM 120100；Muckle Wells综合征（MWS）：MIM 191100）。寒冷性自身炎症综合征（CAPS）最严重的形式称为新生儿多系统炎症性疾病（NOMID：MIM 607115），通常由NLRP3的de novo突变引起，表现为持续的发热和荨麻疹、早期听力损失、无菌性脑膜炎、视神经萎缩和骨过度生长。寒冷性自身炎症综合征（CAPS）症状对IL-1β阻断治疗的显著反应验证了IL-1β在驱动表型方面的关键作用，并引导了在其他自身炎症综合征中成功使用IL-1抑制剂的治疗方法。Blau综合征（又称儿童肉芽肿性关节炎，MIM 186580）是一种早发性自身炎症性疾病，其特征是皮肤、滑膜和脉络膜的肉芽肿性炎症，最常见的是与不适当的NF-kB信号传导而不是炎症体激活相关联。

案例

在我们的早发自身炎症性疾病患者调查和治疗方案中（NCT00059748），我们对一名六个月开始发热、倦怠、脾肿大、呕吐、腹泻、轻度十二指肠炎和偶发皮疹的七岁白种女孩（图1a-d）进行了诊断。最初认为发热是由于反复的病毒感染引起的，但感染、免疫缺陷和恶性肿瘤等相关检验结果均为阴性，预示着可能存在一种自身炎症综合征。随着时间的推移，慢性炎症和皮质类固醇依赖性导致生长不良。高炎症标志物、慢性贫血、转氨酶升高、高三酰甘油血症、高铁蛋白血症、白细胞减少和血小板减少与严重发作不符合寒冷性自身炎症综合征（CAPS）的特点，但可能存在巨噬细胞活化综合征（MAS）（图1e）。

图1 患有NLRC4突变患者的严重发作与巨噬细胞激活综合症（MAS）一致。（a）和（b）在发作期间出现的消失性荨麻疹样皮疹，具有皮肤刺痕性。（c）超声测量脾肿大，最长尺寸相当于年龄匹配的z值为3.3239。（d）18个月龄时为呕吐和体重增长不良而获得的十二指肠粘膜活检的H＆E显微镜照片（20×放大倍数），显示基质内非特异性混合性炎症浸润和轻度绒毛短小。（e）用于监测巨噬细胞激活综合症（MAS）的实验室标志物。

巨噬细胞激活综合症（MAS）和相关的血液组织细胞吞噬淋巴组织细胞增生症（HLH）是一种危及生命的全身免疫失调疾病，与无法控制的巨噬细胞激活和红细胞吞噬现象有关。巨噬细胞激活综合症（MAS）/噬血细胞性淋巴组织细胞增生症（HLH)急性发作表现为发热、全血细胞减少、高甘油三酯血症、自然杀伤细胞功能受损和非常高的血清铁蛋白，如果不及时治疗，可进展为凝血障碍、器官衰竭和死亡。巨噬细胞激活综合症（MAS）是某些风湿疾病（包括系统性红斑狼疮、成人型Still病和系统性少年特发性关节炎）的已知并发症，但在寒冷性自身炎症综合征（CAPS）或其他周期性发热综合征中很少见。巨噬细胞激活综合症（MAS）/噬血细胞性淋巴组织细胞增生症（HLH)也可以由感染（如EB病毒）和恶性肿瘤触发。对家族性噬血细胞性淋巴组织细胞增生症（HLH)发病机制的洞察来自于遗传学发现，PRF（编码穿孔素）或其他必要的穿孔素/粒酶介导的杀伤机制基因的缺失导致巨噬细胞和树突状细胞的无限激活和存活。受损的细胞毒杀机制驱动了噬血细胞性淋巴组织细胞增生症（HLH)和巨噬细胞激活综合症（MAS）的发病。需要提醒的是，寒冷性自身炎症综合征（CAPS）和巨噬细胞激活综合症（MAS）的遗传基础是不同的。寒冷性自身炎症综合征（CAPS）与NLRP3基因突变有关，而巨噬细胞激活综合症（MAS）是由于免疫细胞的异常激活所致。

本文的患者NK细胞功能正常，噬血细胞性淋巴组织细胞增生症（HLH)和周期性热病综合征的遗传检测结果均为阴性。为了进一步进行分子诊断，她接受了全外显子测序（WES）检测，结果显示在NLRC4核苷酸结合结构域（NBD）高度保守的区域中发生了杂合性的新发突变，导致p.Thr337Ser替换（图2a，b）。该变异经Sanger测序确认，并根据保守性、致病性预测软件的预测以及超过6500个对照等位基因组成的Exome测序计划（ESP）数据库和>150个外显子组成的内部集合的缺失（图2b）预测为致病性。基于最近由Hu等人解决的高度同源的小鼠NLRC4的晶体结构，构象分析表明这种突变可能会使螺旋结构域1与NBD残基170和/或173的相互作用不稳定，或直接影响ADP结合，任何一种情况都可能是维持NLRC4处于自我抑制状态所必需的（图2c）。Romberg等人报告了一种类似于反复发作的巨噬细胞激活综合症（MAS）的附近杂合性NLRC4突变

图2：(a) NLRC4基因的染色体位置、相邻基因和外显子结构以及NLRC4蛋白的结构域。(b) 显示de novo杂合突变的家系图。(c) NLRC4蛋白中高度保守的核苷酸结合域中的氨基酸置换位置

探讨

我们假设这种突变可能导致NLRC4炎症小体活性增加，并引发NLRC4介导的巨噬细胞激活综合症（MAS）（随后称为NLRC4-MAS）。支持这一假设的是，我们发现一组血清细胞因子在NLRC4介导的巨噬细胞激活综合症（MAS）中升高，而在对照组或NOMID患者中未见升高，其中包括炎症小体活化的细胞因子IL-18（在NLRC4-MAS中从8,316 pg/mL上升到17,355 pg/mL，在NOMID中从102 pg/mL上升到1,281 pg/mL，在对照组中从56 pg/mL上升到105 pg/mL，见图3a）。血清IL-18水平的升高也与系统性JIA25、AOSD26、感染27和XIAP缺陷28中的巨噬细胞激活综合症（MAS）相关。在NLRC4介导的巨噬细胞激活综合症（MAS）中独特聚集的其他血清标志物包括巨噬细胞刺激因子（M-CSF、IL-12p4029）、凋亡因子（TRAIL、LTα）、趋化因子（CCL7、CXCL12、IL-16）和造血生长因子（SCF、IL-3）（见图3a）。比较NLRC4介导的巨噬细胞激活综合症（MAS）患者、NOMID患者和健康对照者的转录组分析同样显示出与凋亡相关的基因上调和与巨噬细胞活化基因下调的失调相关，尤其是在NLRC4介导的巨噬细胞激活综合症（MAS）疾病爆发样本中。这些发现与巨噬细胞的刺激或活化以及凋亡和造血上调一致。我们还发现，在NLRC4介导的巨噬细胞激活综合症（MAS）爆发期间，calgranulin S100A8、S100A9和S100A12是最高度上调的基因之一，但在活跃的NOMID患者中仅略有上调（图3b）。增加的calgranulin表达与粒细胞增多无关。当calgranulins从活化的单核细胞和中性粒细胞中释放出来时，它们作为损伤驱动促炎反应相关信号，在败血症及系统性JIA/AOSD和地中海热中特别高，但在CAPS33中不高，这表明诱导calgranulin损伤反应可能有助于区分NLRC4介导的巨噬细胞激活综合症（MAS）和NLRP3驱动的炎症。

图3 外周血特征标志物区分NLRC4介导的巨噬细胞激活综合症（MAS）患者和健康对照组、NOMID患者（a）我们对NLRC4-MAS患者、健康儿童对照组、患者家属以及NOMID患者的血清进行了多重细胞因子分析。(b) 对NLRC4介导的巨噬细胞激活综合症（MAS）患者和七名NOMID患者进行了全血转录分析

结果

由于NLRP3突变导致单核细胞和巨噬细胞中炎症体激活和IL-1β/IL-18分泌增加，因此我们对患者细胞中这些反应进行了研究。虽然ATP是NLRP3炎症体的经典触发因子，但小鼠研究表明NLRC4炎症体的激活是由细胞质内的鞭毛蛋白触发的。与Toll样受体在细胞表面识别鞭毛蛋白不同，NLRC4炎症体识别鞭毛蛋白的一个不同区域，该区域已通过细菌分泌系统注入（如在S. typhimurium或L. pneumophila感染中所见）。我们在经过脂多糖（LPS）引导后，验证了患者单核细胞和单核细胞源性巨噬细胞中自发和刺激后的反应，刺激包括NLRP3（ATP）和NLRC4（细胞内鞭毛蛋白，IC-FLA）炎症体激活触发物。

正如预期的那样，来自NLRC4介导的巨噬细胞激活综合症（MAS）患者和NOMID患者（NLRP3，G569R）的单核细胞在所有刺激下产生的IL-1β和IL-18明显高于健康对照组，但NOMID和NLRC4-MAS单核细胞之间的IL-1β分泌没有差异（图4a）。然而，NLRC4介导的巨噬细胞激活综合症（MAS）巨噬细胞分泌的IL-1β比NOMID巨噬细胞更多。有趣的是，与NOMID和健康对照组相比，NLRC4介导的巨噬细胞激活综合症（MAS）单核细胞和巨噬细胞中IL-18的分泌是自发的（图4a）。在刺激下，单核细胞中IL-18没有显著上调，但在刺激的巨噬细胞中显著上调。IL-18水平在刺激的巨噬细胞中比单核细胞高4-5倍，表明激活的巨噬细胞是IL-18的重要来源（图4a）。IC-FLA诱导的细胞因子产生在长时间刺激下仍能持续，这表明该突变影响了细胞因子反应的动力学和幅度。与健康和NOMID对照组相比，NLRC4介导的巨噬细胞激活综合症（MAS）单核细胞中独立于炎症小体的细胞因子IL-6、TNFα和IL-10的产生增加，特别是在IL-1阻断治疗之前。然而，来自NLRC4介导的巨噬细胞激活综合症（MAS）患者的匹配单核细胞来源的巨噬细胞并没有过度产生这些细胞因子（图4a）。综上所述，这些结果表明NLRC4介导的巨噬细胞激活综合症（MAS）单核细胞的反应性增加，NLRC4介导的巨噬细胞激活综合症（MAS）巨噬细胞特异性地过度产生IL-1β和IL-18，NLRP3和NLRC4炎症小体在诱导IL-18激活和分泌方面发挥不同的作用。

图4 NLRC4介导的巨噬细胞激活综合症（MAS）单核细胞和巨噬细胞具有增加的炎症体相关细胞因子分泌、细胞死亡和ASC聚集形成

激活炎症小体还会导致一种称为焦亡的炎症性细胞死亡。为了验证自发和刺激诱导的细胞死亡，人单核细胞衍生的巨噬细胞在有或没有IC-FLA刺激的情况下培养，并监测乳酸脱氢酶（LDH）的释放。自发的细胞死亡在患者的巨噬细胞中显著高于健康对照组或NOMID患者的巨噬细胞（图4b）。同样，IC-FLA刺激引起的细胞死亡在患者的巨噬细胞中明显高于对照组（图4c）。

炎症小体的激活会引起与CARD领域相关的凋亡相关点样蛋白（ASC/PYCARD）的寡聚化成聚集体，这是激活caspase-1和细胞因子产生所必需的过程，可以通过荧光显微镜观察到。我们对NLRC4介导的巨噬细胞激活综合症（MAS）和对照单核细胞衍生的巨噬细胞中自发和刺激诱导的ASC聚集进行了评估。NLRC4介导的巨噬细胞激活综合症（MAS）巨噬细胞显示自发的ASC聚集，而LPS和/或IC-FLA刺激并未显著改变其聚集，而对照组巨噬细胞显示刺激依赖的ASC聚集（图4d，e）。这些结果证实了NLRC4介导的巨噬细胞激活综合症（MAS）巨噬细胞的固有炎症小体激活。

为了调查NLRC4突变的激活效应，我们将WT或T337S突变NLRC4构建物或空载体病毒稳定转染到THP1骨髓单核细胞中，并评估炎症小体活性。尽管使用了高达200倍于WT病毒的突变体，但THP1细胞中mutNLRC4的表达始终低于WT，这表明突变转染细胞的增殖劣势（图5a）。尽管NLRC4表达较低，但我们测量到mutNLRC4转染的THP1细胞中增加了自发性caspase-1裂解（图5a）。从mutNLRC4转染的THP1细胞中分化出的巨噬细胞也显示出增强的IL-1β（mutNLRC4=5.5-10.6倍于EV，而wtNLRC4=2.4-5.9倍于EV，p=0.01）和IL-18（mutNLRC4=5.2-11.4倍于EV，而wtNLRC4=2.1-6.7倍于EV，p=0.03）分泌（图5b）。这些发现支持NLRC4突变通过固有性caspase-1激活实现增强功能。

图5 携带突变NLRC4的细胞表现出自发性炎症小体活性。

鉴于在NLRP3介导的疾病中成功使用IL-1阻断策略，该患者开始接受重组IL-1受体拮抗剂（anakinra）治疗。经过IL-1阻断治疗后，患者的发作频率、C反应蛋白、脾肿大和强的松剂量均大幅降低（图6a）。治疗7个月后，患者没有发热或临床发作，已逐渐停用皮质类固醇和秋水仙碱（图6a）。她没有治疗相关的不良事件，但在短暂的病毒性疾病后出现了暂时性的转氨酶升高和LDH和铁蛋白水平升高。与持续的亚临床炎症一致，她的血清细胞因子模式在接受anakinra治疗后并没有恢复正常（图3），并且她的单核细胞和巨噬细胞的细胞因子产生在治疗后也没有改变（图4）。

图6 IL-1受体拮抗剂治疗使系统性炎症标志物恢复正常并停止类固醇治疗，但血清IL-18仍然升高。(a) 显示anakinra治疗前后C-反应蛋白（CRP）、血清铁蛋白和泼尼松剂量的时间轴图。红线表示anakinra治疗的开始。虚线代表正常上限。(b) 检测了NLRC4介导的巨噬细胞激活综合症（MAS）患者、健康小儿对照组、患者家族以及6例NOMID患者在接受anakinra治疗前后的血清细胞因子水平

在激活过程中，NLR蛋白的NBD介导寡聚化对于随后的效应功能是至关重要的。本文的研究和Romberg等人的研究将NLRC4的NBD的增强功能突变与巨噬细胞激活综合症（MAS）的临床和免疫表型联系起来。在NLRP3的NBD中的突变导致寒冷性自身炎症综合征（CAPS）的持续性炎症体活性，而在CARD15 / NOD2的NBD中的增强功能突变导致Blau综合症。这些NLR中类似的激活突变的存在，NBD域的强物种保守性以及NBD在介导自我抑制中的作用支持构成性NLR寡聚化是这三种疾病中的重要机制。与寒冷性自身炎症综合征（CAPS） / NOMID患者不同，我们患者的NLRC4突变导致很高的循环和刺激IL-18水平，类似于其他巨噬细胞激活综合症（MAS）易感条件中观察到的水平。不同调节NLRC4与NLRP3炎症体激活的因素和分子机制大部分是未知的，需要进一步研究。此外，非造血细胞（成骨细胞，肾上腺皮质，肠上皮等）产生的IL-18可能会逐步对NLRC4介导的巨噬细胞激活综合症（MAS）与寒冷性自身炎症综合征（CAPS）患者中构成性高血清IL-18水平做出贡献。

本文的功能性数据支持NLRC4蛋白的增强功能，并支持通过IL-1β和IL-18过度产生和增加焦亡症的机制来激活病理性巨噬细胞。本文的数据首次表明，在没有原发性细胞毒性缺陷的情况下，巨噬细胞内在缺陷可以驱动巨噬细胞激活综合症（MAS）表型，从而为巨噬细胞激活综合症（MAS）的发病机制提供了新的式。在NLRC4中的激活突变会导致一种新的自身炎症性疾病，表现为周期性发热综合征伴有巨噬细胞激活综合症（MAS），与寒冷性自身炎症综合征（CAPS）和Blau综合征不同，并部分对IL-1抑制有反应。即使在IL-1阻断治疗后，高血清IL-18水平和巨噬细胞的超响应性仍然存在，这表明IL-18在巨噬细胞激活综合症（MAS）中起着作用，并需要探索IL-18作为治疗靶点的可能性。