【笔记总结】高中生物——【选一 Ⅱ】第二章 微生物的培养与应用

第二章 微生物的培养与应用

一、培养基

定义：根据微生物对营养物质的不同需求，配制出供其生长繁殖的营养基质——培养基
基本成分：水，碳源，氮源，无机盐，生长因子，能源（部分物质可同时充当多个成分）
类别：
①固体/液体培养基（凝固剂，常用琼脂），固体培养基还能培养出肉眼可见的菌落（常用）

②通用/选择/鉴别培养基，常用于对照实验中
特殊：乳酸杆菌——添加维生素
霉菌——碱性
细菌——中性或微碱性
厌氧微生物——无氧

二、消毒灭菌

Ⅰ 消毒：杀死微生物和部分芽孢

①煮沸消毒法：100℃，煮沸5~6min，可杀死微生物细胞和部分芽孢
②巴氏消毒法：用于不耐高温的液体，70~75℃煮30min/80℃煮15min，可杀死微生物且营养成分不被破坏
③化学药剂消毒，如酒精，氯气
④物理消毒，如紫外线照射30min

Ⅱ 灭菌：杀死微生物和全部芽孢

①灼烧灭菌：接种环，接种针或其他金属用具，直接在酒精灯火焰的充分燃烧层灼烧（即外焰），可以迅速彻底的灭菌
②干热灭菌：玻璃器皿和金属用具等，将灭菌物品放入干热灭菌箱内，在160~170℃加热1 ~2h
③高压蒸汽灭菌：先将灭菌物品放置在盛有适量水的高压蒸汽灭菌锅内，将水加热煮沸，冷空气彻底排除后将锅密闭，继续加热使气压上升，一般在压力位100kpa，温度为121℃持续15~30min。
注意：必须等待压力表的压力降到0才能打开排气阀，否则可能1、因为气压差导致冷空气倒灌使器皿破裂2、蒸汽喷出造成伤害

三、牛肉膏蛋白胨固体培养基

制备过程：计算——称量——溶化——灭菌——倒平板
注意事项：
①称取牛肉膏用玻棒挑取——牛肉膏比较黏稠
②称取时动作要迅速，称后要及时盖上瓶盖——牛肉膏和蛋白胨都容易吸潮
③溶化时，将称好的牛肉膏连同称量纸一同放入烧杯
④在融化过程中，不断用玻棒搅拌使其溶解——防止琼脂糊底而导致烧杯破裂
⑤配置好后进行高压灭菌+干热灭菌
⑥倒平板注意事项
1、右手拿装培养基的锥形瓶，左手拔出棉塞
2、右手拿锥形瓶，将瓶口迅速通过火焰（杀菌）
3、用左手将培养皿1打开一条稍大于瓶口的缝隙(不是完全打开)，右手倒入培养基，左手立即盖上皿盖
4、等待平板冷却凝固，将平板倒过来放置——Ⅰ使冷凝水不会从皿盖滴至皿底Ⅱ

四、接种方式

Ⅰ 平板划线法

原理：逐步稀释聚集菌种，直至分离成菌落：由一个细胞繁殖而来的肉眼可见的子细胞群体
注意事项：
1、每次划线前后必须灼烧接种环
2、每次划线要打开一条缝隙，从上一次的末尾开始，划3~5条平行线
3、最后一区的划线不能与第一区相连
4、全过程在酒精灯旁进行

Ⅱ 稀释涂布平板法

原理：将菌液进行一系列的梯度稀释，然后将不同稀释度的菌液分别涂布道琼脂固体培养基的表面进行培养。
注意事项：全程在火焰旁操作

壹.系列稀释操作
1、将分别盛有9mL 无菌水的六支试管灭菌，然后按10¹~10⁶编号，之后梯度稀释
2、每次将菌液注入试管后，用手指轻压橡皮头，并吹吸三次——使菌液和水充分混匀
3、移液管需要灭菌，操作时试管口和移液管应在离火焰1~2cm处

贰.涂布平板操作
1、每次涂布平板时仅取少量菌液（不超过0.1mL）
2、灭菌涂布器前要取下胶头，灭菌时将沾有少量酒精的涂布器在火焰上引燃，待引燃后冷却8~10s
3、涂布时可转动培养基，使菌液分布均匀

五、菌种保存

①冰箱保藏：4℃，每3~6个月要转移培养基
优点：方便
缺点：保存时间不长，容易污染

②甘油管藏：-20℃冷藏箱，3mL甘油馆+1mL甘油+1mL菌液
优点：保存时间长
缺点：比较麻烦

六、菌种分离

①筛选菌株

1、根据目的菌对生存环境的需求，到相应的环境中去寻找

P.S：细菌在土壤中占比70%_{90%**，在酸碱度接近中性的潮湿土壤中生长，绝大多数分布在**距表层3}8cm的土壤层，因此要铲去表层土
P.P.S：取土样使用的工具都要先进行灭菌，但取土样这一操作不视作无菌操作（常考点）

[2、如果该菌株占比少，先进行选择培养（富集培养）]

3、使用选择培养基进一步培养

②统计菌落数目

采集样品，并用稀释涂布平板法，在适宜温度下培养适宜时间（可计数）

P.S：
细菌：30-37℃，1-2d
放线菌：25-28℃，5-7d
霉菌：25-28℃，3-4d

注意事项：
1、涂布多个平板取平均值
2、一般选择菌落数30~300的平板计数
3、统计菌落数往往<实际数目。原因：多个细胞连在一起时，只观察到一个

③设置对照

目的：排除实验组中非测试因素对实验结果的影响，提高实验可信度
注意：一般需要空白对照，也有随时间变化自成对照的，请仔细分析

七、纤维素酶

①基本概念

纤维素：多糖，葡萄糖组成
纤维素含量较高：棉花，木材，作物
纤维素酶：一种复合酶，至少包括三种组分：C $_1$酶，C $_x$酶，葡萄糖苷酶
前两种酶使纤维素分解为纤维二糖，第三种酶将纤维二糖分解为葡萄糖
（全 文 背 诵）

②菌种筛选

主要原理：刚果红可以与像纤维素这样的多糖物质形成红色复合物，而不与纤维二糖/葡萄糖反应
鉴别方式：观察加入刚果红的培养基是否产生透明圈，透明圈R：内圈菌落R越大，纤维素分解菌效果越好

P.S：在将样品稀释涂布到鉴别纤维素分解菌的培养基之前可以先选择培养（富集培养）

常考点1：涂布平板时加入刚果红 or 长出菌落后加入刚果红？

第一种：无需洗去浮色，但生成透明圈的菌种可能是分解刚果红的
第二种：一定程度上保证筛选精度，但需要用NaCl溶液洗去浮色

常考点2：纤维素分解菌的选择培养基/鉴别培养基构成

1、选择培养基（液）
纤维素——主要碳源（不是唯一碳源）
酵母膏，水解酪素——生长因子，碳源、氮源
各种盐——无机盐，(调节PH的作用）

2、鉴别培养基（固）
（好像不常考，懒得写了）

常考点3：确定是否为纤维素分解菌
在初步的筛选之后，进行发酵产纤维素酶的实验，可液体/固体发酵
测定方式：对 纤维素酶分解滤纸等纤维素后所产生的葡萄糖 进行定量的测定

小结

培养基这一章知识点比较密集，而且比较杂，我谈下个人看法：
1、本章的实验要点非常多，尤其是培养基和培养菌种的方式，建议对这两块单独记忆，而不是照着书一小节一小节的复习
2、考试中反而是选择题最头疼，因为考一些记不太清的细节，实验题反倒还好，因为考察重点会在对照实验上面
3、某些特殊的定义和数字要重视（比如复合酶，30~300）。物质浓度和量相关的数字基本不考，但大字部分的一定牢记。

探究酶的用量对果胶酶活性的影响

分开保温再混匀：将果泥和果胶酶分装在不同的试管中恒温处理，可以保证底物和酶在混合时的温度是相同的，避免了果泥和果胶酶混合时影响混合物的温度，从而影响果胶酶活性的问题。
实验原理：酶浓度增加时，过滤到的果汁体积也增加，说明用量不足；当浓度到达某个值后，再增加酶的用量，过滤到的提及不再变化，说明用量已经足够，那么这个值就是酶的最适用量
关键：时间长短对最适用量也有影响
意义？？：工业生产中，降低生产成本（设备成本，酶的成本
②可以考虑分浓度进行对照比较
自变量：（0mg）1mg 2mg……9mg
探究是否具有作用：需要空白对照
探究最适用量：不需要0mg
因为是定量实验，要进行重复实验求平均值以减小误差
酶加入到苹果泥中：苹果泥呈粘稠固液混合，会有残留
过滤的果汁中含有果胶酶

操作提示————————
1、制备果泥：用榨汁机，橙子可以不必去橙皮
2、探究pH的影响时可以用0.1%的NaOH和盐酸调节
3、可以不用玻璃棒搅拌
流程：水果——榨汁——瞬间高温灭菌（90℃），类似巴氏灭菌，主要因为没有易凝固/蒸发成分——冷却——酶处理（45℃，1~3h）——离心分离——过滤——浓缩——瞬间高温灭菌（90℃）——包装——制品
第一次高温灭菌：水果自带的微生物

课题3 分解纤维素的微生物的分解
知识要点
①纤维素—（C1酶，Cx酶）—纤维二糖—（葡萄糖苷酶）—葡萄糖
分布：植物的根茎叶等器官
②纤维素酶：至少包含上面三个，是复合酶
③刚果红：与纤维素这样的多糖物质形成红色化合物，不与水解后产物反应
④筛选纤维素分解菌：刚果红染色，数量多少看透明圈半径与菌落半径之比

实验要点
①振荡试管——>使酶与滤纸充分接触
②振荡培养——>异养需氧菌
③选择培养：先进行富集培养，使目的菌的比例上升，与选择培养基目的不同
④倒平板时就加入刚果红，不需要用NaCl洗去培养基表面浮色；在培养后再加入，可以避免有细菌分解刚果红的情况出现，更容易筛选
⑤最后还要进行进一步鉴定，即通过发酵产生纤维素酶，发酵有固液两种。测定方式：对纤维素酶分解滤纸等纤维素后所产生的葡萄糖进行定量测定。
⑥在配置标准液时，要注意等梯度的稀释，

洗衣粉含酶（X)
洗衣粉含酶制剂（U•ェ•*U）
评价生物实验
①是否设置对照试验
②单一变量原则、等量原则（无关变量）、（可重复）

蛋白酶洗衣粉不能洗布料
纤维素酶洗衣粉可以洗棉衣（去浮毛，变蓬松）

自生≠自养

清水漂洗之后还要晾干
洗衣粉中的酶由基因工程+微生物培养生产而来
涂布多个平板——重复实验——减小误差
控制无关变量——排除非测试因素的影响

固定化酶

①物理吸附法：利用各种吸附剂或含酶菌体吸附在载体表面上而使酶固定的方法
通常：物理/离子吸附法
常用吸附剂：活性炭，氧化铝，硅藻土，多孔陶瓷
优点：酶不参加化学反应，整体结构保持不变，催化活性得到很好保留，操作简便条件温和，不会引起酶变性或失火，且载体廉价易得，可反复使用，利于催化大分子底物的反应

②化学结合法

是将酶通过化学键连接到天然的/合成的高分子载体上；使用偶联剂通过酶表面的基团将酶交联起来，而形成相对分子量更大，不溶性的固定化酶的方法
确定是酶活性可能受到影响

③包埋法

酶被裹在凝胶的细格子中或被半透性的聚合物膜包围而成为格子型和胶囊性两种。此法只适用于小分子底物和产物的酶催化反应，因为只有小分子反应底物或产物才可以通过高分子聚合物进行扩散

由于酶分子较小，容易从包埋漏出，所以酶的固定更适合采用化学结合和物理吸附法固定。细胞体积大，难以被吸附和结合，多采用包埋法固定。

注：若将纤维素酶进行物理吸附，由于需要三种酶协同合作，因此效果也许不如别的方式

固定化酶和水溶性酶相比的优缺点
优点：
1、可重复使用，效率提高，成本降低
2、固定化酶极易与反应体系分离，简化了提纯工艺，收率高，质量好
3、固定化后稳定性得到提高，比较能耐受温度和PH变化（物理影响不大，化学比较大
4、固定化酶具有一定的机械强度，可以用搅拌或装柱的方式作用于底物溶液，便于酶催化反应的连续化和自动化操作
缺点：
1、固定化可能导致酶的部分失活，酶活力有损失（尤其是化学，中间酶不易与反应物接触
2、固定化酶的使用成本增加，初始投资增大
3、与完整菌体细胞相比，固定化酶不适宜于多酶反应
4、胞内酶进行固定化时必须经过酶的分离纯化操作

使用固定化酶的生产原理：
将葡萄糖异构酶固定在颗粒状的载体上，再将这些酶颗粒装入反应柱种，柱子底端装上分布着许多小孔的筛板（让酶不能过，反应物可以过——半透膜）
产操作：
1、将葡萄糖溶液从反应柱上端注入，从下端控制流速和反应时间（开口大小）
2、流过时接触固定化的葡萄糖异构酶，42%~45%转化为果糖，从下端流出
可连续使用半年，大大降低生产成本，提高果糖产量和品质

固定化细胞计数：
利用物理/化学方法将细胞固定在一定空间的技术。
重点1：是活细胞，会生长发育繁殖遗传新陈代谢
重点2：要提供营养物质——可视为液体培养基
重点3：是为了获得酶和代谢产物

包埋法：
将微生物细胞均匀的包埋在不溶于水的多孔性载体中
如 明胶 琼脂糖 海藻酸钠
醋酸纤维素可做成 分离DNA 聚丙烯酰胺分离蛋白质

优点：成本低，操作容易，活性影响小，可催化一系列反应，适宜多酶反应
缺点：大分子物质难以自由通过细胞膜。反应物为大分子时，最好选用固定化酶技术（物理吸附

已知 $f(x)=kx^3lnx$的极小值为 $-\frac{1}{3}$
（1）求k
（2）令 $V=\frac{f(u)}{e}$，当 $V>2e^6$，证明 $\frac{1}{7}<log_v^{sqrt(u)}$