【转录组入门】03：了解fastq测序数据

操作：需要用安装好的sratoolkit把sra文件转换为fastq格式的测序文件，并且用fastqc软件测试测序文件的质量

作业：理解测序reads，GC含量，质量值，接头，index，fastqc的全部报告，搜索中文教程

具体步骤

【1】SRA文件转换成fastq文件

-----单个文件转换

fastq-dump --gzip --split-3 -O outputdir -A file1.sra

-----多个文件批量转换

# 1、编写一个脚本  sra_to_fq.sh
for I in `seq 56 62`
do
    fastq-dump --gzip –split-3 -O ./fastq/ -A SRR35899${I}.sra
done
# --split-3：如果是双端测序数据，则输出两个文件，如果不是则只输出一个文件
# --gzip：输出格式为gzip的压缩文件（fastqc软件可以直接识别gzip压缩的文件）
# -A：accession序列号，输入的文件
# -O：outdir输出文件夹，指定输出路径

# 2、运行脚本
bash sra_to_fq.sh

【2】QC（测序质量分析）：多个文件批量进行

$ fastqc  -q  -t  4  -o  ./fastqc_result/  *.fastq.gz  &
# -t 8：调用8个核心
# -q ：安静运行，在运行过程中不会生成报告，只会在结束时将报告生成一个文件
# -o ../FastQC_result.raw/ ：文件输出位置，输出到当前文件夹下的FastQC_result 子目录中
# *. fq.gz：，输入文件：当前目录下所有名字中有“  .fq.gz  ”的文件

【3】查看QC结果

1、单个查看：鼠标双击打开html文件查看

2、批量查看：使用 moltiqc软件: moltiqc *fastqc.zip

Fastqc结果报告关注重点：

1）.basic statistics

2）.per base sequence quality

3）.per base sequcence content

4）.adaptor content

5）.sequence duplication levels

主要的几个指标是GC含量，Q20和Q30的比例以及是否存在接头（adaptor）、index以及其他物种序列的污染等。

测序数据去掉接头：cutadapt

删掉测序质量差的reads：fastx_trimmer

理论知识

高通量测序之所以能够能够达到如此高的通量的原因就是他把原来几十M，几百M，甚至几个G的基因组通过物理或化学的方式打算成几百bp的短序列，然后同时测序。

在测序过程中，机器会对每次读取的结果赋予一个值，用于表明它有多大把握结果是对的。从理论上都是前面质量好，后面质量差。并且在某些GC比例高的区域，测序质量会大幅度降低。

因此，我们在正式的数据分析之前需要对分析结果进行质控

第三行质量序列格式

目前illumina使用的碱基质量格式为phred+33, 和Sanger的质量基本一致。

Name	ASCII character range	Offset	Quality score type	Quality score range
Sanger, Illumina (versions 1.8 onward)	33–126	33	PHRED	0–93
Solexa, early Illumina (before 1.3)	59–126	64	Solexa	5–62
Illumina (versions 1.3–1.7)	64–126	64	PHRED	0–62