高通量测序方法：单细胞测序，空间转录组测序，转录组测序
样本设置：13例未治疗病例的54个样本，6例新辅助化疗有疗效病例的30个样本，5例新辅助化疗无疗效病例的13个样本，共计89个样本，进行单细胞测序；2个新辅助化疗有疗效病例的结直肠癌和肝癌组织共4个样本和2个新辅助化疗无疗效病例的结直肠癌和肝癌组织共4个样本，共计8个样本，进行空间转录组测序；430个病例的单细胞测序
取样部位：结直肠癌的癌和癌旁组织；肝转移的癌和癌旁组织；淋巴组织，PBMC
研究思路
主要研究结果
1、单细胞测序和空间转录组测序准确量化结直肠癌肝转移的免疫细胞
对20个病例的89个样本进行单细胞测序，共捕获178,630个CD45+细胞，鉴定到髓系细胞，CD8+ T细胞，CD4+ T细胞，NK细胞和B细胞等几大类。其中，T细胞在不同组织类型里不同类别细胞的比例差异较大，显示了组织间的免疫异质性。通过4个病例的8个样本的空间转录组测序，并结合单细胞测序结果，可量化不同免疫细胞亚群。在未治疗的样本中，CD8+ T细胞在结直肠癌和肝转移的样本中，均有高度富集。经新辅助化疗治疗的样本，肿瘤区域减少。空间转录组测序整合单细胞测序分析，可以在空间范围内定量呈现不同系吧类别的比例和空间分布，为解析空间范围的免疫微环境提供更全面的数据。
2、MRC1+ CCL18+ 巨噬细胞在转移肿瘤中高度富集
作者随后分析了各类免疫细胞在各个组织中的相对含量，显示不同部位的免疫细胞类别和丰度差异较大。某些免疫抑制细胞，如PDCD1+ CD4+ T细胞和CTLA4+ CD8 + T细胞，在结直肠癌和肝转移肿瘤中丰度相当，而SPP1+巨噬细胞和MRC1+CCL18+巨噬细胞在肝转移肿瘤中丰度更高。随后，通过27人的队列进行多色免疫荧光验证，已经133人的队列进行基因芯片分析，获得了一致的结果。利用TCGA的430人的队列的RNAseq数据，进行预后分析，显示SPP1+巨噬细胞和MRC1+CCL18+巨噬细胞与预后负相关。
派森诺生物的话
通过比较case与control之间的细胞数目的差异，关注到SPP1+巨噬细胞和MRC1+CCL18+巨噬细胞，通过大队列的验证，证明这两类细胞在大范围人群中普遍存在，通过TCGA数据库进行预后分析，暗示挑选细胞可能是解释疾病的关键细胞类群。通过这样的思路筛选出来的细胞类群，后续进行深入的分析。
3、SPP1+巨噬细胞和MRC1+CCL18+巨噬细胞的功能
首先通过细胞通讯分析各类免疫细胞和肿瘤细胞的细胞间通讯，结果显示，SPP1+巨噬细胞和MRC1+CCL18+巨噬细胞与肿瘤具有非常强的通讯，并且，两者的通讯是通过CD47和SIRPA进行通讯的，并利用多色免疫荧光验证这两类细胞定位于相同的空间区域。随后，比较了结直肠癌和肝脏转移的样本这两类细胞的差异表达基因及其信号通路，结果显示肝转移肿瘤组织的SPP1+巨噬细胞和MRC1+CCL18+巨噬细胞代谢相关的信号通路高度富集。
通过细胞通讯分析，关注到特定的基因，后续可以通过生物学验证，验证ligand或receptor参与该生物学过程的机制（详细实验设计方案，可参考公众号文章【单细胞测序+外显子测序+转录组测序+免疫组化+免疫荧光+流式+WB+细胞实验+预后分析】多组学联合解析胆囊癌免疫逃逸机制）。此外，关注到代谢相关的信号通路高度富集，可以通过代谢组学测定进行验证（关于单细胞测序和代谢组测序联合分析方案，请联系您的派森诺销售顾问，派森诺为您提供个性化解决方案）。本文采用了第三种方案，研发了ScMetabolism算法，深入分析单细胞测序数据的代谢通路，为科学研究提供更多的技术支持。
4、ScMetabolism分析鉴定到肝转移肿瘤中MRC1+CCL18+巨噬细胞代谢大大增强
ScMetabolism分析显示MRC1+CCL18+巨噬细胞有42条代谢通路上调，其代谢相关基因的表达，也大大提高。此外，作者也做了MRC1+CCL18+巨噬细胞的geneset score分析，包括抗原呈递，血管形成，免疫抑制等，进一步分析关注细胞的功能。
5、新辅助化疗有效和无效的免疫微环境差异
为了探索新辅助化疗的抗肿瘤疗效，作者对CD45+细胞进行了聚类分析，结果显示结直肠癌和肝转移肿瘤的细胞类别存在较大差别。为分析新辅助化疗对细胞的影响，分析了不同类别的差异表达基因，在有疗效的病例中，免疫抑制细胞减少，杀伤性细胞增多。在肝转移肿瘤中，MRC1+CCL18+巨噬细胞和SPP1+巨噬细胞巨噬细胞均减少。而在无疗效的病例中，这两类细胞的数目增多，杀伤性T细胞的数目减少。
6、新辅助化疗影响巨噬细胞的代谢
鉴于新辅助化疗主要影响髓系细胞，尤其是巨噬细胞，因此，新辅助化疗是否影响巨噬细胞的演化，是一个随即提出的问题。对不同组的拟时序分析结果显示，有疗效的病例富含演化轨迹上早期的单核细胞，而缺少演化末端的巨噬细胞，如MRC1+CCL18+巨噬细胞和SPP1+巨噬细胞；而无疗效的病例这两类细胞的含量大大增加。通过对27个病例的多色免疫荧光，进一步验证MRC1+CCL18+巨噬细胞和SPP1+巨噬细胞在有疗效的病例中浸润减少。ScMetabolism分析显示有疗效的病例的髓系细胞代谢下调。
拟时序分析可以把case和control放在一个演化轨迹上分析，比较case和control是否存在不同的演化轨迹，在更多的情况下，比较两者在演化轨迹上的细胞数目的差异。
7、多病灶肿瘤的免疫异质性
多病灶肿瘤在肿瘤疾病中非常常见，不同病灶的免疫微环境异质性，以及其对新辅助化疗的响应，目前还不清楚。作者分析4个多病灶病人的不同病灶，显示不同病灶的免疫微环境差异显著，免疫抑制细胞，如MRC1+ CCL18+的细胞在不同病灶的浸润差异显著。
总 结
本文做了89个单细胞和8个空转，并结合大队列的验证，为结直肠肝转移提供了详尽的图谱，并通过比较新辅助化疗治疗疗效差异的不同病例，解析新辅助化疗的作用机制。对于全景的描绘，最终聚焦到两类巨噬细胞，分析细胞数目、基因表达差异、信号通路分析，最终将图景式的描绘，聚焦到分子水平的机制解析，为单细胞测序数据挖掘，提供思路参考。更重要的，本文将信号通路分析聚焦到代谢通路，为临床研究提供靶向药物筛选的依据。