题目：Analysis of Single-Cell RNA-Seq Identifies Cell-Cell Communication Associated with Tumor Characteristics
摘要
肿瘤生态系统由多种细胞类型组成，通过配体-受体相互作用进行通信。靶向配体-受体相互作用（例如，与免疫检查点抑制剂的相互作用）能对患者提供巨大的好处。然而，我们对于哪一个互作发生在肿瘤中以及这些互作如何影响预后了解的仍然不够。我们提出了一种通过使用单细胞RNA测序在微环境中跨所有细胞类型的配体-受体相互作用表征通信的方法。我们用这个方法去识别和比较出现在六个合成的小鼠肿瘤模型中的配体受体互作。为了识别可能与预后相关的互作，我们将互作对表型生长率的表型做回归分析。除此之外，我们用人类黑色素瘤数据来量化T细胞亚群之间的配体-受体相互作用及其与免疫浸润的关系。总体而言，这种方法为研究细胞间相互作用，它们在肿瘤中的变异性以及它们与预后的关系提供了一种工具。
背景
结果
1.对合成的小鼠模型进行单细胞RNA-seq测序
合成的小鼠模型通常用于研究肿瘤的免疫治疗。然而，关于配体受体互作不同的模型仍然存在不完全的理解。我们对6个小鼠肿瘤模型（每个肿瘤模型两个样本）进行单细胞测序。共5种癌症类型。因为一些模型很少被免疫细胞浸润，我们额外富集了CD45阳性细胞。CD45是白细胞共同抗原，广泛存在于白细胞表面。根据T细胞表达的CD45分子的类别不同，可将人类T细胞分为CD45RA+初始T细胞和CD45RO+记忆T细胞。值得注意的是，被测细胞频率在分类群体和未分类群体之间有很好的相关性(决定系数[R2]=0.73，p=5.63107，图A)，主要差异仅在免疫细胞浸润不良的B16-F10模型。
总共，获得了超过10000个细胞的mRNA(557 for B16- F10 cells, 4,479 from CT26 cells, 780 from EMT6 cells, 1,677 from LL2 cells, 1,310 from MC-38 cells, and 1,670 from Sa1N cells) The average num ber of reads per cell was approximately 72,000, and a median of approximately 2,500 genes was detected per cell .
为了检查我们的scRNA-seq测量是否反映蛋白质丰度，我们将同一肿瘤的单细胞悬液与抗体平行染色，并分析 流式细胞仪分离的蛋白质标记的表达。将单细胞测序技术与流式细胞分选技术相比较，发现二者得到的单细胞的频率是相关的，如下图A。除此之外，我们还计算了5种免疫细胞的频率，发现这两种方法还是有很强的相关性A（图B）。
这些数据共同表明，scRNA-seq的测量重新记录了流式细胞仪测量的细胞类型丰度和标记表达
2、 基于小鼠肿瘤模型scRNA-Seq数据的细胞类型分类
这小节提出了一个新的方法划分细胞类型。
为了识别细胞之间的互作，首先要将细胞划分类型。由于scRNA-seq技术的局限性，如m RNA捕获效率，收集的数据包含未检测到的基因。 这种现象被统称为“zero dropout”，使得基于单个标记基因的细胞类型的识别对于数据集中的所有细胞都是不可行的。 因此，我们改进了一种先前发表的有监督分类方法来分配细胞类型。 我们首先手动定义一个细胞类型列表，用于在数据集中搜索，然后指定定义每个细胞类型的标记基因。如下表
为了判断每个细胞对每个marker是positive还是negative，我们拟合了高斯混合模型对每个marker基因的表达值，然后为为每个数据集中的细胞分配一个混合成分。我们测试这个高斯模型包含1到5个成分来允许多模型基因表达的可能性的发生。然而，。 然而，在所有情况下，除了一个(Rpl29)，包含两个成分的混合模型最适合使用贝叶斯信息准则(B IC)作为模型选择的度量的基因表达谱。
在我们将每个标记基因的细胞标记为阳性或阴性后，我们创建了一个高置信度细胞的训练数据集，该数据集与单个细胞类型的指定标记基因图谱相匹配 .以这种方式，我们从不同的模型中识别出了肿瘤细胞、免疫细胞（13 B cells, 62 cancer-assosciated fifibroblasts [CAFs], 21 endothelial cells, 495 macrophages, 23 natural killer [NK] cells, 142 T cells, and 55 dendritic cells [DCs]）和基质细胞。训练集数据包含2/3的细胞。 这个训练数据集是保守的，因为受零辍学影响的细胞被排除在外。于是乎我们用这个训练集数据去训练一个有监督的决策树分类器，去预测剩下的细胞的细胞类型。
为了避免过拟合，我们只用了前500个变异基因然后做了主成分分析对输入数据降维。（主成分覆盖95%）这使得分类器更鲁棒对dropout数据和噪音数据。用5倍交叉验证验证分类器的准确性。
用这个分类器，我们预测了细胞的细胞类型。 我们还计算了每个细胞被分配指定标签的概率，只保留了具有95%以上概率的细胞。平均每个模型有6%的细胞没有被分配标签。
在聚类的过程中，巨噬细胞有点不一样，小鼠同基因模型中的单个细胞按恶性细胞模型和非恶性细胞的细胞类型聚类(图1A和1B)，但巨噬细胞除外。 巨噬细胞表现出依赖于组织背景的可塑性，肿瘤模型对巨噬细胞的聚类可能是由于肿瘤的微环境不同所致。 此外，巨噬细胞似乎也根据小鼠的菌株分离。下图为巨噬细胞在不同模型和不同小鼠种族的聚类图
非CD45富集样品中已鉴定细胞群体的频率因模型而异，说明免疫浸润对不同肿瘤的众所周知的变异性。在免疫群体中，巨噬细胞是所有模型中最丰富的免疫细胞类型，占免疫细胞的80%-95%。。 所有肿瘤模型均显示T细胞浸润，T细胞约占免疫细胞的2%-12%，这取决于肿瘤模型 。 在B16-F10和Sa1N模型中，NK细胞的百分比从不到1%的免疫细胞变化到LL2模型中的大约5%。在六种肿瘤模型中的四种中检测到B细胞，占总免疫细胞的1%-2%。 最后，DCs是最稀有的免疫细胞群体，并被检测到 在Sa1N肿瘤模型中。
3、 利用已知配体-受体相互作用的细胞细胞间作用
定义了细胞类型，然后我们量化了肿瘤微环境中所有细胞类型之间潜在的细胞-细胞相互作用。我们用了一个1800对已知的或者文献挖掘的互作， 其中包含趋化因子、细胞因子、受体酪氨酸激酶(RT K)和肿瘤的受体配体相互作用 坏死因子(TN F)家族与细胞外基质(ECM)-整合素相互作用。此外，我们还加入了已知的B7家族成员的互作，因为它们和癌症的免疫治疗有关。
为了确定在六种同基因肿瘤模型中保守的潜在的细胞-细胞相互作用，我们筛选了每个肿瘤模型，以确定给定配体-受体相互作用的两个成员的情况 由肿瘤微环境中存在的细胞类型表示。我们计算了平均配体表达和平均受体表达，将二者相乘得到一个互作分值，计算了每个肿瘤模型的互作得分之后，我们又将6个模型的互作得分计算均值，以此来识别保守的互作。 考虑到细胞-细胞相互作用的数量，我们筛选了(大约1500对配体受体对转换为小鼠同系物[人类到小鼠同系物转换]和64对组合。 细胞类型)，我们还使用单边Wilcoxon秩和检验评估了每个相互作用评分的统计意义，并进行了Benjamini-Hochberg多重假设校正。
虽然我们计算了所有已识别的细胞类型的相互作用，但我们选择强调CAFs或巨噬细胞分泌配体的相互作用，因为这些细胞类型是许多配体的主要来源。此外，我们检查了所有涉及肿瘤细胞的相互作用。
许多高互作得分的互作是趋化因子家族。趋化因子互作经常涉及到相同的受体，包括Ccr1, Ccr2, Ccr5，和它们呢都共享配体，包括Ccl2, Ccl4, and Ccl12.。尽管趋化因子配体主要被巨噬细胞表达，而趋化因子和细胞因子配体广泛的被T细胞，B细胞，巨噬细胞和NK细胞表达。除了趋化因子外，我们还观察到许多与细胞外基质有关的相互作用。CAFs分泌多种ECM成分，包括胶原(如Col1a1和Col1a2)和纤维连接蛋白(Fn1)，它们与整合素受体(如Itgb1和Itga5)和CD4等粘附受体结合 ，在所有细胞中广泛表达。 我们还观察到金属肽酶(MMPs)、金属蛋白酶组织抑制剂(TIMPs)、崩解素和金属蛋白酶(ADAMS)的分泌， 它们都参与调节肿瘤的细胞外环境。
观察到许多得分最高的相互作用涉及到共同的配体和受体，这表明我们的度量所得分很高的相互作用可能主要是由配体受体中的一个所驱动的。 因此，我们研究了细胞类型特异性受体和配体在所有相互作用中的表达。
我们首先计算了所有配体-受体相互作用的配体表达、受体表达和相互作用评分(图S3D)之间的成对相关性。配体表达和受体表达均与相互作用评分（中位数相关性分别为0.26和0.35）密切相关。 此外，检查配体表达、受体表达和相互作用评分之间的关系(图S3E)表明，一般情况下，只有当 配体和受体都高表达时，才会发生强的相互作用评分。
4、 细胞-细胞相互作用分数与感兴趣表型的关联
接下来分析细胞互作与表型之间的关联，也就是对生物体的影响。
接下来，我们想讨论如何利用相互作用分数来获得对相关生物表型感兴趣的预测洞察力（例如，肿瘤生长或抗肿瘤免疫反应）。 在没有治疗条件的情况下，我们将每个肿瘤模型的肿瘤生长速率作为感兴趣的表型。 然后，我们计算了所有六种肿瘤模型的相互作用分数与肿瘤生长速率之间的Spearman相关性。由于我们专注于肿瘤生长速度，我们只显示了涉及肿瘤细胞的相互作用，尽管非肿瘤细胞之间的相互作用也是相关的。
我们观察到许多ECM相关的相互作用与肿瘤生长呈正相关。我们还观察到许多与肿瘤生长速率相关的趋化因子和细胞因子相互作用。 肿瘤细胞既分泌表皮生长因子(E GF)又表达Erbb3受体的自分泌相互作用与肿瘤生长呈正相关。 此外，分泌血小板衍生生长因子(PDGFC和PDGFD)的CAFs与与PD GFF结合的血管内皮生长因子(VEGF)(Vegfa和Vegfc)配体之间的相互作用 肿瘤细胞上的Pdgfrb和VEGF受体与肿瘤生长速率呈正相关。
这小节主要分析了图C中与肿瘤生长成正相关或负相关的互作，并没有详细的解释生物学意义。
一般来说，我们观察到许多与特定表型密切相关的相互作用包含相同的受体但是是不同的配体。 然而，也有许多情况下，相互作用评分与肿瘤生长速率密切相关，但受体和配体都没有强烈相关。因此，我们单独计算了配体或者受体与肿瘤生长速率的相关。 我们观察到与表型高度相关的相互作用评分通常要么具有较高的受体相关性，要么具有较高的配体相关性。 这一结果并不是意料之外的，因为相互作用分数是受体表达和配体表达的产物，因此不是独立的。 然而，也有许多情况下，相互作用评分与肿瘤生长速率密切相关，但受体和配体都没有强烈相关。 此外，我们还观察到受体表达和配体表达具有相反的强相关性（图的左上和右下区域）的情况，这 表明相互作用分数相关并不仅仅反映配体和受体的相关性。
5、 定量分析人类转移性黑色素瘤的相互作用
接下来，我们将我们的方法用于定量细胞间的相互作用，用于已发表的人类转移性黑色素瘤数据集 。 我们采用同样的分类方法来识别细胞类型，并使用Tirosh等人识别的标记量化细胞类型百分比。 （2016）
此外，我们选择了预测为T细胞的细胞，并再次应用了我们的方法 进一步将细胞分类为CD8细胞、T辅助细胞或调节性T细胞。 鉴于T细胞在肿瘤微环境中的复杂相互作用及其在成功免疫治疗反应中的重要性，我们研究了Tregs的相互作用。我们发现有许多互作涉及到趋化因子家族的成员。和以前的发现一样，大量的趋化因子的互作共享相同的配体，包括由B细胞，巨噬细胞以及T细胞亚组分泌的CCL3，CCL4，CCL5。 此外，我们还观察到细胞因子相互作用，分别涉及IL10和IL15配体以及IL10RA和IL2RG受体。 由于Tregs的免疫抑制作用，我们也 挖掘B7家族相互作用的个体肿瘤，Tregs表达配体，CD8T细胞表达受体 。 我们观察到许多抑制相互作用的表达，包括CD274(PD-L1)-PDCD1(PD-1)、CTLA4-CD80和CTLA4-CD86相互作用。然而，尽管这些B7相互作用平均发生在所有黑色素瘤样本中，但是对单个肿瘤的检查显示这些相互作用是患者特异的。
我们再次希望评估相互作用评分与单独分析受体或配体的价值。除了计算互作得分与表型的相关，我们还计算了配体或受体与表型的相关。 尽管相互作用评分相关性与受体和/或配体相关性之间有着普遍的相关性，但我们再次观察到受体和配体都没有强烈的相关性 与表型有关，但相互作用评分密切相关(图4C)。
为了理解观察配体-受体对与Treg百分比相关的概率，尽管受体和配体都与Treg百分比无关，我们重新计算了相关性 使用随机配体受体对。 我们评估了在图4C中确定的相互作用的重要性，方法是使用随机相互作用与配体-受体相互作用的一个成员是相同的，并对另一个成员进行 相互作用的ER（即使用相同的配体，但计算与随机受体的相互作用分数，反之亦然） 然后，我们比较了这些随机对与观察到的实际相互作用的相关性。 对于图4C中识别的两种交互，随机交互对没有真正的交互那么强烈。 此外，我们还计算了配体与随机受体之间的相互作用比配体的原始相关性更强的可能性。 一般来说，配体相关性越强，随机配体受体对越不可能表现出更大的相关性。 此外，这一结果表明，配体受体对不会偶然与表型相关，即使配体表达单独与表型密切相关。
为了研究相互作用评分如何与人类转移性黑色素瘤背景下感兴趣的表型相关，我们使用肿瘤中T细胞数量的Tregs百分比作为表型。 考虑到我们计算了19个不同肿瘤样本的分数，除了使用Spearman相关性外，我们还构建了一个使用最小绝对收缩和选择操作的预测模型 r(LASSO)回归。 对于人类黑色素瘤数据集，我们从9，408个测量的细胞-细胞相互作用作为预测因子开始（总共可能有187，000个=100个细胞类型对3，1870个配体-受体相互作用）。然后，我们用5倍交叉验证训练了一个回归模型，并确定了一组能够预测Treg百分比的11种相互作用。 在Tregs及其配体TN FSF15上表达的肿瘤坏死因子家族受体TNF RSF25的相互作用，以及在巨噬细胞、WER上表达的TNF RSF21受体的相互作用 Tregs百分比的预测。 此外，产生PSEN1的B细胞与NOTCH受体成熟所需的蛋白水解酶的相互作用 Tregs(Struhl和Greenwald，1999年)也预测了Tregs的百分比。
讨论
在本工作中，我们开发了一种计算方法来分析scRNA-seq数据，以筛选肿瘤微环境中存在的所有细胞类型之间的配体-受体相互作用。 我们应用该方法，以确定六种不同的同基因小鼠肿瘤模中常见的细胞-细胞相互作用，并确定人类转移性黑色素瘤的患者特异的相互作用。 此外，我们证明 评价这些相互作用分数如何可以作为相关和预测模型的特征，以确定配体-受体相互作用作为生物标志物或潜在的治疗靶点。
