猪伪狂犬病（Pseudorabies virus，PRV）是一种主要发生在猪身上的急性传染病，对全球养猪业造成了严重的威胁。现有的商业疫苗也未能防止新的PRV菌株出现。因此，迫切需要新的手段和策略来控制PRV的传播。
迄今为止，应用蛋白质组学来分析PRV-宿主细胞互作机制的研究还很少。因此本文采用TMT标记定量蛋白质组学方法来比较PRV感染后宿主细胞的蛋白表达差异，为进一步揭示PRV发病机制和潜在的抗病毒靶点提供理论依据。
技术线路
1、PRV诱导的细胞蛋白表达差异
为了分析PRV感染过程中宿主细胞蛋白表达量的变化，本文对ISG15-/–PK15细胞（ISG15敲除的PK15细胞）进行蛋白质组学分析(图1A)。在PRV和Mock比较组中，共鉴定出4958个肽段，筛选出241个差异表达蛋白（差异倍数＞1.2或＜0.83，P值<0.05），与Mock组相比，PRV感染的ISG15-/–PK15细胞中有162个差异蛋白显著上调，79个差异蛋白显著下调 (图1B)。
图1 火山图和聚类热图
2、RT-qPCR和Western Blot验证
为确保蛋白质组学数据的可靠性，随机选取8个蛋白(AFP、Hsp40、Herc5、Mcc1、Vtn、Strap、Fn1和IL18)进行RT-qPCR和Western blot验证。此外，选择PRV-gE蛋白用于验证PRV复制。如图2所示，RT-qPCR和Western blot结果与TMT定量蛋白质组学一致(图2)。以上结果表明，使用TMT标记方法筛选的DEP具有很高的可信度。
图2 RT-qPCR和Western blot验证
3、差异蛋白的GO富集分析
GO功能可分为生物过程(BP)、细胞成分(CC)和分子功能(MF)三个部分。对差异表达蛋白进行GO富集分析，在生物过程中，差异蛋白主要在单一的生物过程、代谢进程、免疫系统进程、多细胞进程、发育进程富集。在细胞组成中主要富集到细胞部分、细胞器、胞外基质、超分子纤维、细胞连接等term。在分子功能中，差异蛋白在结合活性、催化活性、分子功能调节因子、结构分子活性、转运活性和抗氧化活性均显著富集(图3)。
图3 GO富集分析
4、差异蛋白的KEGG富集分析
KEGG富集分析结果表明，241个差异表达蛋白显著富集在7个通路，包括PI3K-Akt信号通路、黏着斑通路、补体和凝血级联反应、紧密连接通路、肌动蛋白细胞骨架调节、细胞外基质(ECM)-受体相互作用、碳水化合物消化吸收(图4A)。如图4B所示，差异蛋白主要富集在PI3K信号通路以及补体和凝血级联反应通路(图4B)。
图4 KEGG富集分析和PPI网络分析
为进一步明确差异蛋白之间的相互作用，我们对差异表达蛋白进行PPI网络分析。如图4C所示，差异表达蛋白被定位到两个主要的功能相互作用网络，与先天免疫相关的POP1-SURF6-RPL7L1-ISG15-CCL5-C5-C9-CFB-F5-APOB-IGFBP7以及与细胞周期和细胞成分相关的INCENP-KIF20A-PCLAF-ISG15-CCL5-IL18网络。值得注意的是，这两个网络中至少有4个hub蛋白：ISG15、CCL5、GRWD1和C5(图4C)。PPI网络中，有5种存在较强相互作用的蛋白与免疫应答和PRV复制有关，分别是ISG15、CCL5、C5、C9和AFP。综上所述，这些结果有助于阐明PRV与宿主之间的相互作用，并为PRV诱导的宿主免疫逃逸机制提供理论依据。