期刊名：Journal of Proteome Research
发表时间：（2019年9月）
IF：3.78 （2018）
单位：巴塞尔大学，瑞士
物种：人细胞系
技术：冷冻电子显微镜（Cryo-EM），单粒子电子显微镜
一、 概述：
本文描述了一种“差异视觉蛋白质组学”（DVP）方法，在蛋白质组学层面研究不同样本间蛋白质和蛋白质复合体的结构变化。细胞裂解后，用无损方式制备成单粒子电子显微镜的上机样品，扫描成像。图像中的单个蛋白质粒子被提取出来，排列，归类，用定量分析法找到阴、阳性对照样品间蛋白质粒子结构的差异。单细胞受到干扰后，可用该方法发现蛋白质组学中的结构变化。
二、 研究背景：
蛋白质和蛋白质复合物的三维结构与蛋白质的功能息息相关。蛋白质组学研究中的金标准，质谱，并不能完全体现蛋白质的结构。现有的冷冻电子显微镜（EM）或免疫金标分析方法可以反应蛋白质的三维结构，但存在一定局限性，比如通量不高，操作、分析复杂，能检测的蛋白质不多，等等。本文提出了一种基于单粒子电子显微镜的单细胞间的蛋白质组学结构比较方法，展示了样品处理过程和分析算法，包括细胞裂解，电子显微镜上机前的微流控准备步骤，处理和未处理细胞系的可视化比较过程。通过比较不同样本组的蛋白质三维结构差异，可以寻找到新的蛋白质、蛋白质复合物，或者重新排列的蛋白质复合物。
三、实验设计：
四、研究成果：
1.用DVP算法分析模拟的冷冻显微电镜数据。作者创造了三个数据集，每个数据集中有100张显微镜图片，包含8种蛋白质。图a展示了数据集2，黑框部分放大了3个数量级。DVP算法从300张显微镜图片中提取了58300个蛋白质粒子，粒子二维排列分析产生了44类蛋白质粒子的二维分类家族，图b展示了其中24类。
2.用DVP算法分析模拟的冷冻显微电镜数据，与上图使用相同数据。图a，将从每个数据集里鉴定到的蛋白质粒子归类，统计数目，同一蛋白类别（不计方向）的粒子被归纳为一大类。图b，蛋白质粒子归类，同一蛋白且同一方向的粒子被归为一类，不同方向却同一蛋白的粒子被归为一大类。
3. 相比于大蛋白粒子（Ursease, GroEL等），小蛋白粒子（如Hsc70, HscB和HspA）难以被正确检测，不好归类。图a是模拟数据集中的蛋白粒子分类统计，图b是计算机检索模拟数据集后鉴定到蛋白粒子分类统计。比较图a和图b，数据集中蛋白粒子的数量分布和DVP算法检索到蛋白粒子数量分布存在线性关系，但是小蛋白粒子（HscB和HspA）的实际值和检测值存在差异。
4. 用DVP算法分析批量的HEK293细胞。6份HEK293细胞的蛋白液（来自同一份母液）中加入了不同浓度的尿素酶，负染，用电镜检测。DVP算法从6份样品的120张电镜图片中提取到了96,000个蛋白质粒子（图a是尿素酶含量最高的样品图片示例），其中71,000个蛋白质粒子被准确检测后分成48类（图b展示了其中27类）。随后在PCA图中归纳统计了尿素酶蛋白质粒子的数量（图c中红框圈出了尿素酶粒子）。C1到C6样品中，DVP算法检测到的尿素酶蛋白粒子含量普遍与样品中实际添加的尿素酶浓度呈线性关系，粒子的数量随着浓度的降低而减少。只有C4样品例外，在电镜拍照时就发现尿素酶粒子的数量出乎意料的少。
5. 用DVP算法分析热休克处理的SH-SY5Y单细胞及其阴性对照。DVP算法自动从单细胞样本的200张显微图片中提取到120,000个蛋白质粒子。图a是热休克处理后的单细胞显微图片。处理细胞及其阴性对照样本中有5500蛋白粒子可被准确检测后分为28类，图b展示了其中14类。图c展示了两种样本间粒子丰度差别最大的几类蛋白质。红框圈出了一种环状的热休克蛋白，粒子数目明显在热休克处理后的单细胞（黄色）中更多。
五、文章亮点：
“视觉差异蛋白质组学”（DVP）可以视作常规蛋白质组学研究方法（比如纸质谱）的补充。DVP可以检测单细胞层面或更大量细胞的结构蛋白质组学差异。DVP算法与单粒子电子显微镜分析方法相结合，有效利用了电镜的高分辨率优势。作者承认DVP方法目前在小分子蛋白（＜100kDa）中应用得不太好，无法分辨小分子蛋白粒子的结构特征从而进行有效识别和归类。但随着电镜技术的飞速发展，相信这个难点会很快克服。
阅读人：李思奇
原文链接：https://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/acs.jproteome.9b00447