背景
线性模型需要满足正态性、独立性和同方差性等假设，其中独立性是线性模型最重要的假设之一，独立性要求每一个数据点必须来自于不同的总体。但由于重复测量数据、区组数据以及空间相关数据不能满足独立性假设，因此常常利用线性混合效应模型对上述数据进行分析（如相关性分析）。
使用一般线性模型时，是需要满足以下3点假设的
- 正态性，因变量y符合正态分布
- 独立性，不同类别y的观察值之间相互独立，相关系数为零
- 方差齐性，不同类别y的方差相等
线性混合效应模型的例子
- A. 假设你想研究一个小镇上（4个街区）的平均收入和教育水平的关系，不考虑街区区分选取1000个体样本。如果这样构建模型，忽视了样本之间的相关性，同一个街区的个体不是独立的，因此残差项会于街区关联。
- B. 假设你想研究焦虑y和尿酸，三酸甘油酯的水平，有1000个体，在24小时内测量了10次。如果这样构建模型，y的方差随着时间而变化，从而导致方差异质性，这可以通过残差方差异质性体现出来。
- 在A，由于空间关联性导致样本非独立；在B，存在异质方差性。这两种情况都不适于使用常规的线性模型，但是都可以用混合线性模型。
以一个探索基因表达量与采样距离相关性为例。
该数据来自于“ntegrated transcriptomic analysis of distance-related field cancerization in rectal cancer patients ”。该研究的思路为，取距离肿瘤原发灶不同距离处样本，进行RNAseq测序，找到表达量与距肿瘤远近相关的基因，然后进行功能注释、生存分析等等。
本文以上述数据为依托，用lme4构建线性混合效应模型，找到表达量与距离相关的基因。
为什么采用线性混合效应模型
我们希望找到表达量与距离相关的基因，但因为来自同一个患者的表达量是相关的，所以这128个样本不满足普通线性回归的独立性假设，需要用到线性混合效应模型。
数据准备
# 下载GEO数据
library(GEOquery)
gset <- getGEO('GSE90627', destdir="./raw-data/",
AnnotGPL = F, ## 注释文件
getGPL = F)
# 下载注释文件
gpl <- getGEO("GPL17077",destdir="./raw-data/")
ids <- Table(gpl)
# 获取表达矩阵
a=gset[[1]]
expr=exprs(a)
# 探针id转换成gene symbol
rownames(expr) <- ids[match(rownames(expr),ids$ID),7]
# 获取表型信息
pd=pData(a)
pd <- pd[,c(1,2,37:40)]
colnames(pd)[3:6] <- c("age","gender","patient","tissue")
# 构建出patient和distance变量
library(stringr)
pd$distance <- str_split(pd$title,"_",simplify = T)[,2]
pd$distance[97:128] <- rep("0cm",32)
pd$patient <- str_split(pd$title,"_",simplify = T)[,3]
pd$patient[97:128] <- str_split(pd$title[97:128],"_",simplify = T)[,2]
str(pd) #查看数据结构
save(expr,pd,file = "./Rdata/GSE90627_eSet.Rdata")
# 文章的Supplementary Figure 1记录了每个患者的末端样本距离，复制到excel中，保存为sTable1.csv
load("./Rdata/GSE90627_eSet.Rdata")
# 读入取样末端距离数据
NP <- read.csv("./raw-data/sTable1.csv",header = T, stringsAsFactors = F)
# 将距离改为数字
pd$distance2 <- substr(pd$distance,1,1)
pd$distance2[1:32] <- NP$NP.cm. #前32个恰好是patient1-32的ProximalEnd样本
pd$distance2 <- as.numeric(pd$distance2)
pd$patient <- as.factor(pd$patient)
构建模型
我们先以基因“CXCL1”的表达量为例，基于线性混合效应模型计算基因表达量与距离的相关性。
首先，线性混合效应模型包括2个部分：
- 固定效应：被研究的变量，本例中是“距离”
- 随机效应：希望被控制的影响因素，本例中是“患者”
常用的随机效应公式：
- (1 | g) ：斜率固定，截距变化
- x + (x | g) ：斜率和截距都变化
其中，g 代表随机效应（因子型数据）；x 代表固定效应（数值型数据）
df <- data.frame(CXCL1=expr["CXCL1",],pd[,c(5,7,8)])
library(lme4)
lmer.fit <- lmer(CXCL1~distance2+(distance2|patient),data = df)
summary(lmer.fit)
# summary 结果
Linear mixed model fit by REML ['lmerMod']
Formula: CXCL1 ~ distance2 + (1 | patient)
Data: df
REML criterion at convergence: 456
Scaled residuals:
Min 1Q Median 3Q Max
-1.91585 -0.89480 -0.05695 0.74833 2.34680
Random effects:
Groups Name Variance Std.Dev.
patient (Intercept) 0.01888 0.1374
Residual 1.94671 1.3952
Number of obs: 128, groups: patient, 32
Fixed effects:
Estimate Std. Error t value
(Intercept) 11.55250 0.15984 72.275
distance2 -0.20275 0.02039 -9.946
Correlation of Fixed Effects: # 固定效应的相关性
(Intr)
distance2 -0.618
# 线性相关性
coeff <- summary(lmer.fit)$coefficients[2,1]
模型可视化
library(ggeffects)
library(ggplot2)
pred.mm <- ggpredict(lmer.fit, terms = c("distance2"))
ggplot(pred.mm) +
geom_point(data = df,aes(x = distance2, y = CXCL1, colour = distance),position = "jitter") +
geom_line(aes(x = x, y = predicted)) + # slope
geom_ribbon(aes(x = x, ymin = predicted - std.error, ymax = predicted + std.error),
fill = "lightgrey", alpha = 0.5) + # error band
theme_minimal()
显著性检验
如何检验固定效应是否显著（即基因的表达量与距离的相关性是否显著）？
我们通过检验固定效应模型与去除固定效应模型的差异，判断固定相应的线性相关性。
注意：REML（residualmaximum likelihood），即残差最大似然，默认固定效应是正确的，lmer建模时默认REML=TRUE，所以在判断固定效应是否显著时，要将其设为FALSE，使用ML（最大似然）建模。
fit.full <- lmer(CXCL1~distance2+(distance2|patient),data = df,REML = F)
fit.null <- lmer(CXCL1~(distance2|patient),data = df,REML = F)
anova(fit.full,fit.null,test="LRT") #LRT代表极大似然检验
# 结果
Data: df
Models:
fit.null: CXCL1 ~ (distance2 | patient)
fit.full: CXCL1 ~ distance2 + (distance2 | patient)
npar AIC BIC logLik deviance Chisq Df Pr(>Chisq)
fit.null 5 510.88 525.14 -250.44 500.88
fit.full 6 459.45 476.56 -223.73 447.45 53.428 1 2.683e-13 ***
---
Signif. codes: 0 ‘***’ 0.001 ‘**’ 0.01 ‘*’ 0.05 ‘.’ 0.1 ‘ ’ 1
# pvalue
pval <- anova(fit.full,fit.null,test="LRT")$`Pr(>Chisq)`[2]
pval
[1] 2.682786e-13