昆虫基因组DNA的优化提取，可进行长读测序
1个
美国农业部谷物和动物健康研究农业研究服务中心，美国曼哈顿学院街1515号，KS 66502
2
美国农业部农业研究服务局美国肉类动物研究中心，克莱中心，美国东北67432
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应与之联系的作者。
方法协议。 2019，2（4），89分; https://doi.org/10.3390/mps2040089
收到：2019年10月24日/修订：2019年11月15日/接受：2019年11月19日/发布：2019年11月23日
长读取测序技术继续增加读取长度，目前，平均读取长度可以> 20 kb，最高可达60–80 kb。现在的挑战是提取具有足够片段大小和质量的基因组DNA，以支持更长的读取长度。
我们开发了一种成功的方法，可以从昆虫中
持续获得高质量的长基因组DNA
。确定了用于基因组DNA提取的昆虫的最佳发育阶段是the阶段，可以从摄入的食物中消除DNA，并减少可能干扰提取的几丁质物质的污染。通过商业基因组DNA提取试剂盒的改良程序获得了改进的结果。最初是红色面粉甲虫Tribolium castaneum的软p组织使用特富龙微粉破坏了试剂盒裂解缓冲液中的。对试剂盒方案的修改还包括通过颠倒试管进行温和混合，而不是苛刻的涡旋步骤，并使用宽孔移液器吸头来转移含有基因组DNA的级分。提供了来自一个样品的数据作为成功的下游文库生产和测序的实例。尽管该技术已针对昆虫进行了优化，但使用这些经过改进的程序从其他生物的组织中提取也可以改善长期阅读的测序结果。
1.简介
长读测序正越来越多地用于许多生物学应用，尤其是基因组组装。复杂基因组的从头组装，尤其是那些具有许多昆虫基因组特征的高度重复序列的复杂基因组，可以通过并入长读（> 10 kb）序列而得到改善。需要能够分离基因组DNA的长链段，同时最大限度地减少损伤（例如DNA链的切口）的方案，以改善长期读取的测序数据。
从历史上看，DNA提取的第一个报道是从细胞核中称为“核蛋白”，Friedrich Miescher对此进行了描述[ 1 ]。自该报告以来，已经出现了许多基本分离方案的排列，这些方案从使用表面活性剂或去污剂裂解细胞，通过一般蛋白酶去除蛋白质以及通过RNase去除RNA开始。通过盐沉淀和离心去除蛋白质，RNA和细胞膜脂质。还可以通过添加醇（乙醇或异丙醇），苯酚/氯仿和/或结合至固相（如二氧化硅）并通过改变pH和盐浓度进行洗脱，将DNA与上述污染物分离。
Blin和Stafford [ 2 ]提出了一种分离真核生物高分子量DNA的方法，该方法涉及在Waring Blender中将液氮中的组织匀浆，并获得200×10 6 Da（约300,000）的无缺口DNA。bp）。最近证明了另一种从植物材料中低成本，快速提取基因组DNA的方法[ 3 ]。但是，该方法还使用了在液氮中研磨组织的初始过程，并且我们发现该过程并不总是适用于昆虫，这是因为有限材料的损失和基因组DNA的破坏。
已经开发出许多商业试剂盒，用于快速有效地分离基因组DNA。对于昆虫，Chen等。[ 4]评估了从玉米西部根虫（一种玉米的主要害虫）分离基因组DNA的五种不同的时间，功效和成本方法。这些方法包括使用SDS或CTAB，或使用试剂盒DNAzol（美国俄亥俄州辛辛那提的分子研究中心公司），Puregene（美国明尼苏达州明尼阿波利斯的Gentra Systems）和DNeasy（德国基尔根州希尔根） 。尽管所有五种方法都能产生足够数量的基因组DNA以用于预期的分子应用，但SDS和CTAB提取物却能产生更多的数量，并且降解程度较小。所有试剂盒的优点是不会产生有害的苯酚和氯仿废物，但DNeasy试剂盒的提取时间最短，而Puregene试剂盒的蛋白质污染最少。这些研究人员还发现，使用多达8倍体积的乙醇和4°C可以提高提取的DNA量，
我们评估了许多商业试剂盒，以改进从存储的昆虫中提取基因组DNA的方法，以进行长时间的测序（数据未显示）。我们发现了一种可重复提取高质量长基因组DNA的试剂盒，并且在此证明了我们用常见的储藏产品有害生物Tribolium castaneum（红色面粉甲虫）进行改良的方法。
2.实验设计
基因组DNA提取。在我们评估的市售试剂盒中，我们发现EZNA昆虫DNA试剂盒（Omega BioTek，诺克罗斯，佐治亚州，美国）提供了从昆虫中提取基因组DNA的最一致，最优质的方法。但是，如第3节中所述，对试剂盒随附的协议进行了修改，以提供更高的质量和更长的基因组DNA 。
我们没有遵循建议的液氮粉碎方案，因为我们发现我们损失了样品数量和质量（数据未显示）。取而代之的是，使用10只雄性，雌性或混交性锥栗T（约30 mg）作为起始原料，并在试剂盒裂解缓冲液中进行研磨。蛋白质被蛋白酶K降解；用24：1氯仿：异戊醇提取DNA，并用RNAse消化以去除RNA。分离和纯化基因组DNA ，并通过数字纳米光度计和TapeStation分析来自cast木T的基因组DNA样品的1μL等分试样的质量和数量。
将样品在冰上运输到位于内布拉斯加州Clay Center的USDA ARS美国肉类动物研究中心进行文库构建和PacBio Sequel I测序。该文库按照制造商的建议使用SMRTbell模板制备试剂盒1.0-SPv3进行制备，使用BluePippin上用于插入片段大小选择的15 kb下限边界。
2.1。用料
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昆虫。建立殖民地赤拟谷盗在该中心的粮食和动物健康研究（CGAHR），曼哈顿，KS不断饲养，以维持95％的小麦面粉和5％的啤酒酵母，28°C的饲养阶段（幼虫和成虫） ，相对湿度75％，完全黑暗。用于基因组DNA提取和基因组测序的菌落为GA-2，与原始基因组测序项目中使用的菌落相同[ 5]。我们从储藏昆虫的所有阶段中提取基因组DNA，并确定stage阶段是提取高质量长基因组DNA的最佳选择，因为缺少食物污染和可能阻塞色谱柱的几丁质物质（数据未显示）。因此，早期p（约3 mg）用于基因组DNA提取。
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EZNA昆虫DNA试剂盒（Omega BioTek，美国乔治亚州诺克罗斯；目录号：D0926-02）。
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无菌蓝色小丸杵（Kimble Chase，获自美国伊利诺斯州诺斯莱克市Labsource，美国；目录号：749520-0000）。
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24：1的氯仿：异戊醇（Acros Organics，从美国马萨诸塞州沃尔瑟姆的ThermoFisher Scientific获得；目录号：AC327155000）。
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200和1000 µL宽孔微量移液器吸头（ART TM，可通过ThermoFisher Scientific获得）。
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100％乙醇的200分子生物学鉴定等级（美国宾夕法尼亚州普鲁士国王Decon实验室；目录号：3916）。
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SMRTbell模板制备试剂盒（美国加利福尼亚州门洛帕克，太平洋生物科学公司，版本1.0-SPv3）。
2.2。设备
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摇动培养箱（美国纽约州Hauppauge，Eppendorf的5436型Thermomixer）。
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台式离心机（Sorvall Legend MicroCL 21R，ThermoFisher Scientific）。
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NP80型数字纳米光度计（美国加利福尼亚州西湖村Implen）。
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Tapestation 2200型（美国加利福尼亚州圣塔克拉拉，安捷伦）。
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PacBio Sequel I（太平洋生物科学）。
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BluePippin（Sage Science，美国马萨诸塞州贝弗利市）。
2.3。费用
可以提取样品的费用为每个样品$ 2.29至$ 3.60，具体取决于试剂盒的大小。不包括的其他费用包括消耗品（杵和针尖）和24：1氯仿：异戊醇（500毫升瓶309.50美元）。
3.程序
3.1。破坏组织（5分钟）
将组织（少于25 mg）与EZNA昆虫DNA试剂盒中的350μLCTL缓冲液在1.5 mL无菌微量离心管中合并，并用无菌蓝色沉淀杵用手研磨约2分钟。
3.2。消化蛋白（1–12小时）
从试剂盒中将25μL蛋白酶K溶液添加到CTL缓冲液中的组织中，通过小心地颠倒试管10次来轻轻混合，并在设置为低速的振荡培养箱中于60°C孵育1 h。在室温下在轨道混合器上孵育过夜可以提高产量。
3.3。提取DNA（10分钟）
向样品中添加等体积（350μL）的24：1氯仿：异戊醇。代替建议的涡流，轻轻颠倒20次以彻底混合。在台式离心机中于室温以10,000× g离心2分钟。小心地转移上层水层，避免使用100 µL宽口移液器吸头（每次约250 µL），一次在接口上形成任何乳状沉淀，每次100 µL到干净的1.5 mL微量离心管中。已转移）。
3.4。RNA酶消化（15分钟）
从试剂盒中加入一体积的BL缓冲液和2 µL RNaseA。请勿涡旋，而是将样品轻轻颠倒20次，并在70°C下孵育10分钟。
3.5。提取DNA（5分钟）
向样品中加入一体积（在本例中为500 µL）100％乙醇的200证明分子生物学级。请勿涡旋，而是将样品轻轻颠倒20次。此时，您可能可以看到半透明DNA的浮动链。
3.6。纯化DNA（30分钟）
将500μL带有1 mL宽口移液管吸头的样品添加到插入2 mL收集管（均在套件中提供）的HiBand DNA Mini Column中，并以15,000× g离心1分钟。丢弃滤液，并用其余样品（在我们的情况下为500μL）和相同的HiBand色谱柱重复。
转移所有样品后，将色谱柱转移到试剂盒中也提供的无菌2.0 mL收集管中，并从试剂盒中加入500μLHBC缓冲液（确保已按照试剂盒说明将HBC缓冲液用异丙醇稀释） 。以15,000× g离心1分钟。丢弃滤液，并从试剂盒中加入700μLDNA Wash缓冲液（根据试剂盒说明用100％乙醇稀释）。以15,000× g离心1分钟，然后重复洗涤步骤一次。
洗涤步骤后，以15,000x g的转速将色谱柱再旋转2分钟，以干燥色谱柱基质。将色谱柱转移至无菌的1.5 mL微量离心管中，小心地将50μL试剂盒洗脱缓冲液（已预热至70°C）添加到色谱柱膜的中心，并在室温下孵育5分钟。通过以15,000× g旋转1分钟从柱子上洗脱基因组DNA ；重复一次洗脱过程。评估基因组DNA的质量和数量，并在室温下保存以立即使用。如有必要，可以将样品冷冻在-80°C，但是基因组DNA的长度和质量可能会受到影响。
4.结果
使用商业试剂盒的改良方法成功地获得了来自T草的基因组DNA 。DNA具有推荐用于长读测序的最佳A 260 / A 280和A 260 / A 230比率（表1）。从雌性锥栗。获得的基因组DNA的浓度大约是从雄性obtained获得的基因组DNA的浓度的两倍。通过电泳测量了从T木中提取的基因组DNA ，其峰长大于50 kb（图1）。
从样品B1提取的约40μg基因组DNA用于文库生产和测序。该文库的平均插入长度为8731，插入数N 50 = 14,750（图2）。使用Sequel v2.1化学方法进行测序，从30.0 Gb获得总共3,764,395个亚读，平均长度为7970（图3）。
5.讨论
我们提出了一种快速且可重现的方法，可从昆虫p中获得高质量的长基因组DNA。从昆虫的不同生命阶段提取后，我们发现p提供了没有食物的最佳质量序列，并且使用柱子进行的提取由于几丁质材料的可能性较小。
该方案易于执行，花费了两个多小时才完成，没有过夜的潜伏期。我们对推荐的试剂盒协议进行的主要更改是：
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用杵在CTL缓冲液中匀浆组织，而不是在液氮中研磨；
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始终使用宽口移液管移动任何含有基因组DNA的样品；
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永不涡旋，总是通过轻轻倒转来混合。
该试剂盒包括多种提高DNA产量的方法，例如在洗脱前将洗脱缓冲液在色谱柱上孵育5分钟，然后重复洗脱步骤，这两种方法均用于我们的程序中。还建议将洗脱体积增加至超过100μL，我们没有选择该洗脱体积以免稀释样品。
在修改方案以增加产量和改善基因组DNA的质量时，有一些考虑因素。充分研磨样品以最大化基因组DNA的产量至关重要，但是我们发现在液氮中研磨和转移会导致产量降低，有时质量降低。在裂解缓冲液中用微粉手动研磨几分钟，可得到更高数量和质量的基因组DNA。虽然该试剂盒建议用蛋白酶K孵育4小时可能足以去除污染的蛋白质，但我们发现过夜孵育可提高质量评估中的吸光度比。但是，在孵化期间必须避免剧烈摇动。使用宽口移液器吸头对于转移基因组DNA避免剪切至关重要。如果没有宽孔尖端，请使用无菌剃须刀切片并加宽尖端末端的开口。避免剪切DNA的另一个重要步骤是始终轻轻颠倒试管，切勿涡旋。按照试剂盒方案的建议，必须使用新等分的乙醇才能使DNA充分沉淀。这些建议为从中成功纯化基因组DNA提供了改进T. castaneum用于长时间阅读测序，也已成功用于其他昆虫物种。
作者贡献
概念化，BO；方法论，BO，AM，SS，TS；形式分析，BO，AM，SS，TS；调查，BO，AM，SS，TS；资源，BO；数据管理，BO和TS；写作-原始草稿，BO；写作—审查和编辑，BO，AM，SS，TS；可视化，BO；监督，BO；项目管理，BO；资金收购，BO
资金
这项研究由美国农业部ARS CRIS 3020-43000-032-00D，生态学，基因组学和储藏产品昆虫的管理内部资助。没有使用外部资金。
致谢
感谢Tom Morgan，Kristen Kuhn和Ken Friesen的技术帮助。在本出版物中提及商品名称或商业产品仅是为了提供特定信息，并不意味着美国农业部的建议或认可。USDA是机会均等的提供者和雇主。
利益冲突
作者宣称没有利益冲突。