「Bioconductor」再次提醒，研究植物的不要轻易相信你用的注释包

有人说Y叔的clusterpofiler的GO注释结果和其他工具不一样，后来询问，发现分析物种是拟南芥。这就让我想起了我之前的一篇文章，「Bioconductor」不要轻易相信AnnotationHub的物种注释包, 里面就提到拟南芥的物种包用的注释其实一直都没有更新。究其原因，是因为拟南芥的物种包里的注释一直是从TAIR的FTP下载，而我另一篇文章TAIR周期性更新的注释原来不在FTP服务器上也说了，最新的拟南芥注释信息是要在另外的地方进行下载。

下面就是我拆解Y叔的clusterprofiler验证我的猜想环节。

首先用clusterpofiler::enrichGO调出Y叔的代码是如何写的

enrichGO <- function (gene, OrgDb, keyType = "ENTREZID", ont = "MF", pvalueCutoff = 0.05, 
          pAdjustMethod = "BH", universe, qvalueCutoff = 0.2, minGSSize = 10, 
          maxGSSize = 500, readable = FALSE, pool = FALSE) 
{
  ont %<>% toupper
  ont <- match.arg(ont, c("BP", "CC", "MF", "ALL"))
  # 这个函数获取GO注释
  GO_DATA <- get_GO_data(OrgDb, ont, keyType)
  if (missing(universe)) 
    universe <- NULL
  if (ont == "ALL" && !pool) {
  ...
}

从中发现get_GO_data是用于获取基因对应的GO注释，继续深究这个函数

get_GO_data <- function (OrgDb, ont, keytype) 
{
  ...
  else {
    OrgDb <- load_OrgDb(OrgDb)
    kt <- keytypes(OrgDb)
    if (!keytype %in% kt) {
      stop("keytype is not supported...")
    }
    # 获取orgDb包中的所有关键字
    kk <- keys(OrgDb, keytype = keytype)
    # 获取GOALL 和 ONTOLOGYALL
    goAnno <- suppressMessages(select(OrgDb, keys = kk, keytype = keytype, 
                                      columns = c("GOALL", "ONTOLOGYALL")))
    goAnno <- unique(goAnno[!is.na(goAnno$GOALL), ])
    assign("goAnno", goAnno, envir = GO_Env)
    assign("keytype", keytype, envir = GO_Env)
    assign("organism", get_organism(OrgDb), envir = GO_Env)
  }
  ...
}

被我省略的部分基本都是为了判断是否已经缓存了注释信息，或者是返回结果和我们的目的无关，核心的代码是用select获取物种注释包的GOALL和ONTOLOGYALL内容

kk <- keys(org, keytype = "TAIR")

goAnno <- select(org, keys = kk, keytype = "TAIR", 
       columns = c("GOALL", "ONTOLOGYALL"))

所谓的GOALL指的是一个GO及其它的所有父级词条，所以我们应该用"GO"进行后续搜索。

下一步是找到拟南芥中其中一个基因对应GO。先安装或者加载拟南芥的物种注释包

BiocManager::install("org.At.tair.db")
library("org.At.tair.db")
org <- org.At.tair.db

直接输入org可以看到注释包所用的数据来源

注释来源

接下来，挑选一个基因输出对应的GO

goAnno <- select(org, keys = kk, keytype = "TAIR", 
        columns = c("GO"))
goAnno[goAnno$TAIR == "AT1G01010",]
       TAIR         GO EVIDENCE ONTOLOGY
1 AT1G01010 GO:0003700      ISS       MF
2 AT1G01010 GO:0005634      ISM       CC
3 AT1G01010 GO:0006888      RCA       BP
4 AT1G01010 GO:0007275      ISS       BP
5 AT1G01010 GO:0043090      RCA       BP

如下是我在"20171231"版ATH_GO_GOSLIM.txt查询该基因的结果，我们发现该基因目前拥有13个GO注释，比原来多了8条。

grep '^AT1G01010' ATH_GO_GOSLIM.txt | cut -f 1,6,8,10
AT1G01010   GO:0005634  C   ISM
AT1G01010   GO:0006355  P   IEA
AT1G01010   GO:0006355  P   ISS
AT1G01010   GO:0006355  P   ISS
AT1G01010   GO:0006355  P   ISS
AT1G01010   GO:0006355  P   IEA
AT1G01010   GO:0005634  C   IEA
AT1G01010   GO:0006351  P   IEA
AT1G01010   GO:0006355  P   IEA
AT1G01010   GO:0003677  F   IEA
AT1G01010   GO:0007275  P   ISS
AT1G01010   GO:0016021  C   IEA
AT1G01010   GO:0003700  F   ISS

而在物种包所用的"20150409"版本中，你能找到和org.At.tair.db一模一样的注释内容

grep '^AT1G01010' ATH_GO_GOSLIM.txt | cut -f 1,6,8,10
AT1G01010   GO:0007275  P   ISS
AT1G01010   GO:0005634  C   ISM
AT1G01010   GO:0003700  F   ISS
AT1G01010   GO:0043090  P   RCA
AT1G01010   GO:0006888  P   RCA

所以clusterprofiler没有问题，而是Bioconductor提供的注释包不准确，那我们就应该跳过中间商，直接作分析。

根据「[clusterProfiler] buildGOmap」一文中提到的:

..如果你分析的是GO，并且你的注释只有直接注释，那么你可以用buildGOmap把间接注释加上去，然后再用enricher/GSEA分析，所以现在的流程是buildGOmap(optional and only for GO) -> enricher/GSEA。在现在clusterProfiler里，buildGOmap不会产生文件，而是输出一个data.frame，做为background annotation输入给enricher(超几何检验）或GSEA。

那么正确的做法是，先提取出ATH_GO_GOSLIM中所需的列

cat ATH_GO_GOSLIM.txt | cut -f 1,6,8,10 > ATH_GO_TERM.txt

可以根据http://www.geneontology.org/page/guide-go-evidence-codes，使用grep对GO进行过滤。

然后R语言中导入数据, 为GO的BP, CC, MF 分为构建GOMAP(间接注释)

ATH_GOTERM <- read.table("/data/database/TAIR/20171231/ATH_GO_TERM.txt",
                            sep="\t")
colnames(ATH_GOTERM) <- c("geneID","GOTerm","Ont","Source")
# BP
ATH_GOTERM_BP <- ATH_GOTERM[ATH_GOTERM$Ont == "P",] 
gomap_BP <- data.frame(GO=ATH_GOTERM_BP$GOTerm, gene=ATH_GOTERM_BP$geneID)
gomap_BP <- buildGOmap(gomap_BP)
# MF
ATH_GOTERM_MF <- ATH_GOTERM[ATH_GOTERM$Ont == "C",]
gomap_MF <- data.frame(GO=ATH_GOTERM_MF$GOTerm, gene=ATH_GOTERM_MF$geneID)
gomap_MF <- buildGOmap(gomap_MF)
# CC
ATH_GOTERM_CC <- ATH_GOTERM[ATH_GOTERM$Ont == "F",]
gomap_CC <- data.frame(GO=ATH_GOTERM_CC$GOTerm, gene=ATH_GOTERM_CC$geneID)
gomap_CC <- buildGOmap(gomap_CC)

使用enricher进行富集分析

#  DEG_GENE_ID 指的是你实际的差异表达分析得到基因名
library(GO.db)
goname_BP <- AnnotationDbi::select(x=GO.db, keys = gomap_BP$GO,  keytype = "GOID",columns = "TERM" )
# enricher
ego <- enricher(DEG_GENE_ID,TERM2GENE = gomap, TERM2NAME=goname_BP)

Y叔的clusterProfielr还有一个神奇的工具叫做simplify能够去除冗余的GO，但是目前只认enrichGO的结果。怎么办呢？Y叔提供了一个解决方案:

ego@ontology <- "BP" # 按照需求改成，CC或MF
simplify(ego)

最后以我自己一个分析结果为例，展示下以拟南芥org包作为输入的ecnrichgo和跳过org包用ericher之间的区别。

dotplot(merge_result(list(ego_org= ego_org@resul, ego_new=ego_new@result)))

结果比较

「Bioconductor」再次提醒，研究植物的不要轻易相信你用的注释包

参考资料

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