最近用Cluster和Treeview对454测序结果进行了作图，效果不错，转载一下中文教程。
介绍：
Cluster和TreeView是分析并可视化DNA芯片数据或是其它基因组数据集的软件程序，Cluster用多种不同的方式组织分析数据，TreeView则将这些组织好的数据可视化，这个软件的下一个版本会将这两个软件合成为一个应用程序。
这个说明书是使用这个软件的一个参考，而不是对软件中所用方法的全面分析。很多方法都是从标准的统计聚类中得到的，对于聚类分析的那些非常好的教科书，我们会在最后的参考书目中给列出，参考书目中还包括最新的生物科学的论文，尤其是那些所用的方法与我们的非常相似的论文。
Cluster
导入数据：
用Cluster的第一步就是导入数据，当前版本的Cluster只接受以tab键为分隔符的数据格式，比如Excel，通过点File Format Help可以得到输入格式的说明。
依照惯例，在输入表格中，行代表基因，列代表样本或是不同的观察，下面的例子就是一个时间过程的输入文件：
第一列中的每一行（基因）一般都代表标识符（绿色的字符），第一行中每一列代表样本的标签（蓝色的字符），此时的标签表示时间进程，红色字符代表的是每一行基因的种类是什么，本文件的YORF代表酵母开放阅读框，这个地方可以是任意的字母或数字的值，在TreeView中，应用它可以将每一行的基因连接到外部的网站中。
剩下的数据就是每个基因在不同样本中的表达值，2行4列的“5.8”表示基因YAL001C在2小时观察到的数据为5.8。空数据是允许的，就用空值表示（里面什么都没有），如，YAL005C在2小时的数据就是空的。
我们很可能要对输入数据额外的添加一些信息，最大的Cluster的输入文件如下所示：
黄色的区域是可有可无的，默认情况下，TreeView用第一列的ID号作为每个基因的标签，NAME那一列是对每个基因的进一步描述性标签，从而与第一列的标签相区别，关于GWEIGHT和GORDER这两列和EWEIGHT和EORDER这两行的内容会晚一些再解释。
示例数据：可在http://rana.stanford.edu/software/demo.txt.这个网站中得到，这个数据时酵母基因表达谱数据，下载后并导入到Cluster中。
Cluster会呈现如下的导入信息：
调整过滤数据：可以通过Filter Data和Adjust Data 这两项对数据进行调整和过滤。
调整数据：
Log Transform Data：将每个数值取对数代替原来的数值，即x=log2（x）。
Normalize Genes and/or Arrays:将每一行每一列的所有数值都乘以一个标度因子S，使每一行每一列的数值的平方和为1.0（每行/列的S是不同的）
Mean Center Genes and/or Arrays:将每一行或列的所有值减去这一行或列的平均值，使这一行或列的平均值为0。
Median Center Gene and/or Arrays: 将每一行或列的所有值减去这一行或列的中位数，使这一行或列的中位数为0。
以上的每项调整不是连在一起的，每项的先后顺序是很重要的，在进行之前要仔细的考虑好。
操作的顺序为：
Log transform all values
Mean center rows
Median center rows
Normalize rows
在什么情况下，我们需要对数据进行调整呢？
Log transformation：许多DNA微阵列实验的结果是荧光比值，基本上都需要进行对数化处理。比如一个不同时间点的基因表达值，并将结果与时间点0的值相比较，假设在时间点1，这个基因表达没有改变，在时间点2，它表达上调两倍，在时间点3，它表达下调两倍（与时间点0相比）。则在这三个时间点上，最初的比值为：1,2,0.5。但在多数情况下，我们认为2倍上调和2倍下调的变化幅度应该是一样的，只不过是方向不同，一个上调，一个下调，但在我们的数据中，时间点1和2的变化为1（2-1），时间点1和3的变化为-0.5（0.5-1）。这样的话，上调两倍的变化幅度就是下调两倍变化幅度的2倍，通常情况下，我们并不想要这样的结果，如果我们将所得到的最初数据都取对数，则每个时间点的表达值变为0,1，-1，这样的话，上调2倍和下调两倍对于时间点0的变化幅度就一样了，都是1。在大多数的应用中，都推荐将数据对数化。
Mean/Median Centering：假设这样的一个实验：你观察一下大量的肿瘤样本与同一个参考样本相比较的情况，这个同一个参考样本来自于细胞系的集合。对于每个基因，你会得到一系列的比值，这个比值与这个基因在参考样本中的表达水平相关，由于参考样本与你的实验室毫无关联的，你希望你的分析与参考样本中的基因总数是相互独立的。这个要求可以通过调整能够代表每个基因的变化的特性值而得到，比如平均值或是中位数，这也就是Mean/median centering的功能。Centering能够降低参考样本在实验中的作用，比如在许多的时间进程的实验。
中心化数据还可以消除某种程度的偏差。多数的双色荧光杂交实验的结果都没有对系统误差进行校正，这个误差来源于RNA总量的差异，标记为效率和图像采集参数。这个偏差带来的影响是将所有基因的比值都乘以标量，通过将对数化数据进行Mean或median centering处理可以校正这个偏差，最后基因的平均数期望得到1。
大体上，比起Meancentering，我推荐median centering。
标准化：
标准化设置一行或一列的幅度（值的平方和）向量为1。Cluster中使用的度量距离的大多数方法都用标准化数据向量，但数据的输出格式则还是最初的输入的格式，如果你想输出这种标准化向量格式，你需要选中这个选项。
一个原始的数据样本可以做如下的调整：
1． 对数据进行对数化
2．Median center 基因和阵列
重复第二步5-10次
3．标准化基因和阵列
重复第三步5-10次。
这样做后的结果是，数据将会被对数化，优化了中位数（也就是所有行或列的中位数的值接近0），标准化了数据集（也就是所有的行和列的幅度接近于1）。
做完以上的调整后，你要保存一下数据集。
过滤数据：
过滤数据的作用就是移除那些不满足某些特性的数据。现有的可供筛选的特性有如下几个：
%Present>=X.它的作用是，如果某列的缺失值大于百分之（100-x），则把这列移除，如上图中，x=80，则如果某列的缺失值大于20%，则剔除这一列。
SD（Gene Vector）>=X.移除那些标准误小于X的所有基因。
At least X Observations abs（Val）>=Y.它的作用是，对于某个确定值Y，如果某个基因没有至少X个绝对值大于Y的观察值，则这个基因将被移除。如图中，某个基因不会被移除，那么它的观察值中至少有一个绝对值大于2。
MaxVal-MinVal>=X.移除那些最大值与最小值之差小于X的所有基因。
当数据通过过滤器时，并不会立即应用，软件会先提示你过滤器的结果，如果你愿意接受这个结果，则点击Accept，否则将不会有改变的。
等级聚类
等级聚类即是可以对你的数据进行等级聚类。这是一个非常强大，有用的方法，可以分析各种类型的大基因组数据集。我们在最后的文献引用中列出了关于应用等级聚类分析的论文。
我们通过聚类分析得到的是二元的，凝聚的，有等级的聚类。基本的思想就是将一系列的条目（基因或阵列）组成一个树，如果两个条目非常相似，则它们会由一个短树枝相连，当相似性不断下降时，树枝的长度也会相应变长。
相似性/距离：
我们首先应该解决的问题是“相似性”是如何定义的，计算两串数字的相似性的方法有很多，Cluster提供了少量的选项。对于两串数字（两个向量）X={X1,X2,…Xn}和Y={Y1,Y2,…Yn}的皮尔森相关系数定义为
其中 是X的平均值， 为标准差。
对于相关系数概念的理解有很多种，如果你以X，Y为横纵轴做一个散点图，（即是让X1,Y1为一个点，X2,Y2为一个点，以此类推）那么相关系数r就代表用一条直线来适应这些值的可行性有多大。如果你把X，Y看成N维空间内通过原点的两个向量，那么相关系数r就表示X，Y向量的角度有多大。
最简单的理解相关性系数的方法就是把X，Y画成曲线，r就代表这两个曲线形状的相似程度。皮尔森相关系数的范围是-1到1之间，1表示两个向量完全相同，0表示二者完全相互独立，-1表示二者数值相同，但方向相反，如果两个向量的标量值发生改变（比如将Y中的所有值都乘以2），X，Y的相关系数是不变的，因为不管长度如何变化，两个曲线的形状还是相同的，相关系数还是1，只不过幅度不同。
以上对皮尔森相关系数的表述是教科书中所讲的，如果你想用这种方法的话，直接在Similarity Metric目录下选择Correlation（centered）即可，但实际上，除了这种方法，Cluster还用用另外三种形式的皮尔森相关系数。
Correlation（uncentered）用的是下面经过修改的后的等式。
它与之前的皮尔森相关系数是一样的，只不过它设想平均值是0，尽管没有。二者的区别在于，如果两个向量X，Y是相同形状，但他们通过一个固定的值代偿性相关，则在centered correlation中，他们的相关系数是1，但在uncensored correlation中不是1,。
Cluster提供了两种相似性度量，即是这两个相关性函数的绝对值，对于两个具有相反表达模式的相关性条目，相反基因的标准的相关性系数是很远的。
另外两种度量方法是皮尔森相关系数的非参数形式，如要了解，请参考以下的网页：
http://www.ulib.org/webRoot/Books/Numerical_Recipes/bookcpdf/c14-6.pdf
当X或Y有缺失值时，相似性的计算只取决于那些X，Y都不缺失的条目。
Cluster
选好以上任意一种相关性的度量方法，就可以进行聚类了，第一步是计算要聚类的（比如当前数据集中的基因集）所有条目配对的距离（距离=1-相似性）。这是非常耗时的，计算所有的程序需要我们的机器有较大的内存。
当我们计算好距离矩阵时，就可以开始聚类了，聚类过程是成团的等级聚类过程，即是反复的进行这样的循环：用树中的一个点或是支连接两个最近的条目（就是最短距离的两个），支的长度由两个条目的距离所决定。当一个新的支代替了原来两个聚类的点时，这两个点就被移除了，新产出的支再与其它的点进行聚类，直到最后聚成一类为止。当聚类开始时，我们要处理的有两种类型的条目，一种是真实的条目（比如单个基因），一种是包含许多真实条目的假条目，我们有很多方法来处理假的条目，Cluster提供了三种选择。
如果你点击Average LinkageClustering，我们将用向量来定义每一个假条目，这个向量就是它所包含的所有真实的条目（比如基因）的平均向量。并计算这个向量与剩下所有条目的距离，计算的方法也之前用的相似性度量的方法一样。这样，如果我们将一个包含5个条目的支与一个条目聚成一类形成一个新的支，则这个新的向量是它所包含的六个向量的平均值，而不是聚类的两个向量的平均值（注意，在计算平均值时是不用缺失值的，一个假的条目时可以有缺失值的，如果它所包含的所有条目在某一个行/列上都有缺失值）。对于熟悉聚类算法的读者可知，这与真正的平均聚类是有差别的，两个条目X和Y的距离是X和Y所包含的所有条目的配对距离的平均值。
在Single Linkage Clustering中，两个条目X和Y的距离是X和Y中所包含的所有条目的配对距离的最小值。
在Complete Linkage Clustering中，两个条目X和Y的距离是X和Y中所包含的所有条目的配对距离的最小值。(与Single Linkage Clustering的说明一样？)
加权
默认情况下，所有的条目都是平等的计算的，但有些情况下，你希望给一些值多一些权重，例如，在阵列中，有一个基因有两个副本，当计算距离时，你希望每一个副本的权重都变的小一些，你可以通过在输入文件中使用GWEIGHT(基因加权)和EWEIGHT(实验加权)来设置权重，默认情况下，所有的权重为1，这样，对于X={X1,X2,…Xn}和Y={Y1,Y2,…,Yn}，带权重{W1,W2,…,Wn}的皮尔森相关系数r为：
注意，当你要聚类行（基因）时，你要用列（阵列）的权重。
基于一个不能被完全理解的函数来计算权重是可能的。如果你要计算聚类基因的权重，你要选中在Hierarchical Clustering中的Genes内的Calculate Weights。
你会发现在Array面板中有一个Weight Options的对话框（我知道这可能会让人很困惑，但你看了下面的内容就会明白）。
Calculate Weights的思想就是根据临近的行向量局部密度来权衡每一行（列也是同样的）。如果临近的行向量密度高，则会有低的权重，如果临近的行向量密度低，会有高的权重，我们用以下的公式来计算每一行的局部密度分值L（i）：
其中，k（阈值），n（迭代次数）是用户自己设置的参数（即是Weights Options中的参数设置）。每一行的权重为 。注意到L(i)的最小值是1，因为d(i,i)=0.当L(i)增大时，权重就降低（因为权重是L的倒数）。大于1的n值表示，随着d(i,j)的增加，L(i)的贡献呈指数级下降。
输出文件的排序
聚类的结果是一个树或是成对的树（一个是基因的结果，一个是阵列的结果）。但是，如果我们想要在TreeView中以图形化的方式查看结果，我们需要用这棵树来对最初的数据集的行或列进行重新排序。如果你简单的以下面的方式画出树中的所有节点时，出现的是自然排序的结果：
这样，每个树都可以生产一个排序，但是，对于每个树，它的排序都不是唯一的，如果某个树有N个节点的话，将会有2的N-1次方个排序 （如果有6个基因的话，每两个基因聚一类，就会聚成5类，每一类都有两种排序，所以共有2的5次方种ordering）。你可以翻转树中的任何一个点（改变底部和顶部的树枝），这样你就会得到一个新的排序。默认情况下，当Cluster聚类两个点时 ，它会随机的将它们放在树枝的底部和顶部。如果我们想要对某个给定的树，做最好的排序，就需要用到输入文件中的GORDER（基因排序）和EORDER（实验排序）这两个参数了，或者是在排序之前做自组织映射（下面会讲到）。默认情况下，Cluster设置每一行或列的排序参数为1，当产生一个新的点时，Cluster比较这两个聚类的点的排序参数，并把值小的那个点放在树的顶端，一个点的排序参数是这个点所包含的成员的排序参数的平均值。这样，如果你想要Cluster聚类后的基因排序结果与你的输入文件的排序尽可能的接近，你就要设置GORDER这一列，使这列中的每一行的值是递增的。注意排序参数并不需要一定是唯一的。
输出文件：
Cluster每次聚类后会得到三个输出文件，这三个文件的根目录名字都是你在Job Name这个对话框中所填的内容，当你导入一个文件时，Job Name就被设置到导入文件的根目录下。这三个输出文件的名字如下：
.cdt（聚类的数据表）文件包含基于聚类结果行列排序后的原始数据。它与输入文件的格式是相同的，但如果是根据基因或是阵列聚类的话，会相应的增加一列或一行。增加的这一列或一行是对每列或行的唯一的标识符，它与在.gtr和.atr文件中树的结构的描述是相联系的。
.gtr(基因树)和.atr(阵列树)文件是以tab键为分隔符的文本文件，文件中记录了在基因或是阵列聚类过程中点的聚类的过程（注意到，只有是在相应轴线上的聚类，才有输出文件）。当聚类开始时，每个要聚类的条目都被赋予一个唯一的标识符（比如，GENE1X,ARRY42X），这些标识符被添加到.cdt文件中，当生成一个新的点时，也会有一个新的标识符(比如，NODE1X,NODE2X等)，每次聚合的过程会被存储在.gtr和.atr文件的每一行中，包括新聚合的点的标识符和两个聚合元素的标识符，以及这两个元素的相似性分值，如下所示：
（gtr或是atr文件记录了树的形成过程，第一行，GENE1X和GENE4X两个基因的相似性分值为0.98，她们俩先聚类，形成一个NODE1X，第二次是GENE5X和GENE2X聚类形成NODE2X，相似性是0.80，以此类推，形成的树就是右边的图形，这种文件可以被自动的读入到treeview中。）
当你打开相应的.cdt文件后，.gtr或.atr文件会自动读入TreeView软件中。
TreeView
TreeView为Cluster的结果进行图形化分析，这是非常直观的。
Treeview在使用时经常出问题，要求用Winzip对软件进行解压。 无需安装，双击Win32 Treeview.bat即可。
PS：使用这两个软件之前一定要先安装最新的JAVA。