短读长的RNA-seq已经被应用接近了20年，RNA-seq最常被用于分析基因的差异表达，从那时起它已经成为分子生物学中最常用的工具之一，极大的加速了我们对生物学的理解。但至今为止，准确量化和发现RNA可变剪切亚型（isoform）对基于短读长的RNA-seq仍然是一个挑战。
漫画表示短读长测序解析转录组的方式
使用 PacBio Iso-Seq 测序方法可以捕获完整的转录亚型，但是因为通量有限，并没有被广泛应用，尤其是在单细胞转录组测序领域。为了解决这个问题，Broad研究所的研究人员开发了MAS-ISO-seq技术，这是一种以编程方式将互补DNA (cDNA)连接成最适合HiFi测序的检测长度的技术，能够将单细胞全长转录组测序通量提高了15倍以上。相关研究于2023年6月8日发表于生物科技领域的权威期刊《自然－生物技术》（Nature Biotechnology）。
MAS-ISO-seq技术示意图
为了验证MAS-ISO-seq忠实还原RNA isoform的能力，研究人员对Lexogen SIRV-Set4进行了全长RNA测序。Lexogen SIRV-Set4是一种合成的RNA标准品（包含不同摩尔浓度的69种RNA异构体和4-12k的不同长度）。如下图所示：Smart-seq3异构体组装会有高达43%的错误率，而MAS-ISO-seq可以直接识别isoform，无需生信组装，只有0.4%的错误。
通过Smart-seq3组装和MAS-ISO-seq检测到的SIRV亚型的识别矩阵
为了表征MAS-ISO-seq在单细胞转录组测序中的性能，研究人员对肿瘤浸润性CD8+T细胞进行了10x Genomics 单细胞测序。在经过QC和数据过滤之后，最终获得了5,270个CD8+T细胞，其中中位UMIs为4,041 UMIs/细胞（短读长测序）和1,701UMIs/细胞（MAS-ISO-seq）。
虽然利用短读长测序和HiFi测序得到的测序深度差异很大，细胞聚类和基因表达却高度一致，如下图所示。这说明仅通过HiFi测序就能够独立且稳健地获得细胞聚类结果。
利用T细胞分化过程中CD45的不同剪接模式，研究人员使用CITE-seq在蛋白质水平上对CD45亚型表达进行了正交验证，并将结果与使用MAS-ISO-seq检测的mRNA水平进行了比较。结果显示，这两种模式之间的CD45亚型表达高度一致，如下图所示。
与基于抗体的CITE-seq方法相比，单细胞长读长转录组在解析多种编码CD45亚型（RO、RA、RAB和RBC）方面的能力更加精细。这是因为抗体的单表位特异性限制可能无法区分密切相关的亚型。例如，CD45 RA抗体不能区分CD45 RA和RAB。
基于MAS-ISO-seq方法学，PacBio现已推出针对单细胞全长转录组测序的建库试剂盒 MAS-seq kit。通过将短的10x Genomics cDNA 进行串联建库的方式连接起来再进行HiFi测序，从而解决了长读长单细胞RNA测序的通量瓶颈。
PacBio MAS-Seq的主要特点：
1. 支持由 10x Chromium Next GEM Single Cell 3' 试剂盒 (v3.1) 生成的 cDNA；
2. cDNA 起始量为 15-75 ng；
3. 相较于传统常规单细胞Iso-Seq文库，MAS-Seq将通量扩展了16倍；
4. 突破传统基因水平研究，得到更多全长转录本信息；
5. 在单细胞水平上，实现多样化全长转录本的表征；
6. 研究发现细胞种类特异性的可变剪切群体，及其表达差异；
7. 可以全面解析单细胞的可变剪切、mRNA点突变和融合基因等信息；
8. 一个文库即可以获得 3000-10000 个细胞的转录本水平信息；
9. 当搭配Sequel II/IIe SMRTcell 8M 测序芯片时，可产生 4000 万条转录本序列;
10. 当搭配Revio SMRTcell 25M 测序芯片时，可产生 8000 万条转录本序列。
Sequel II/IIe 和 Revio 系统上运行的 PBMC MAS-Seq 文库的 Reads、细胞和转录本统计数据。
参考文献：
Al'Khafaji, Aziz M et al. “High-throughput RNA isoform sequencing using programmed cDNA concatenation.” Nature biotechnology, 10.1038/s41587-023-01815-7. 8 Jun. 2023, doi:10.1038/s41587-023-01815-7