Biomolecular condensates: organizers of cellular biochemistry
摘要
生物聚集是真核细胞中的形成的微米级别的无膜细胞器，它们可以作为核酸和蛋白质的聚集者。这些聚集的过程涉及多种生物化学过程，包括RNA的代谢，核糖体的再生，DNA损伤修复以及信号转导，近期的研究表明由多价生物大分子互作形成的液液相分离是生物聚集的重要组织原则。由于这些物理性质，他可能解释了这些重要的压力颗粒如何聚集，组成，物理性质和生化以及细胞功能和调控的。
细胞生物学中的一个基本问题是密度不同的物质是如何被包装进入细胞内的一个单独的空间，从而使得生物化学反应只在一个特定的空间和时间内发生。对于空间控制的一种方式是调控反应成分的定位，将反应物质浓缩到同一个反应区室可以增加反应的速率，而将这些反应物隔离起来起来可以抑制反应。这些差异可以改变在特殊的信号流来保护细胞避免损伤激活，不适宜的共价修饰以及低的pH效应等。确实细胞内的反应通常被包裹到一定的反应区室进行。
经典的细胞器，比如ER,Golgi Body都是由膜脂包裹形成的，这些膜对于大多数的生物分子是难以渗透的，因此细胞器内外的物质都是典型被隔开的。细胞器成分的改变都是通过细胞膜上的特殊的受体进行调控的。
但是也存在许多的无膜细胞器，如上图所示 ，包括RNA和蛋白质构成的nucleioli， Cajal bodies 以及PML nuclear bodies等。以及细胞质中的压力颗粒和生殖颗粒，信号分子在细胞膜上的聚集。这些微米级别的结构通过它们在不连续的细胞区室内聚集蛋白质和核酸的能力来定义。这些细胞器无细胞膜来隔绝他们内的成分和区室外外的成分，如何浓缩这些生物分子，保持或者调节他们的结构，控制他们的组分和调节他们内部的生化活性，这些都还有待阐明。
本篇综述中，作者讨论了细胞和生物化学的观察结果，这些观察结果阐述了基于高分子化学和软物质物理学原理的无膜隔室的新物理模型。 该模型在一个共同的框架下将观察到的许多无膜隔室的行为结合在一起，包括膜相关分子簇和细胞质或核结构。 我们讨论该模型如何解释无膜隔室的组装，溶解，组成和功能的许多方面。 我们提出了可以在细胞中调节这些特征的机制。 最后，我们在这个令人兴奋的生物学领域中提出了一系列主要的开放性问题。
液相分离区室
第一个无膜细胞器的发现是在1830s年代神经元细胞的细胞核中，后来被称为细胞核。从那以后在真核细胞的细胞核，细胞质，细胞膜上又发现了其他的区室。高分辨率的显微镜揭示了它们在组成成分和形状和，动态和聚集的方式上的相似点。每一种的无膜区室都包含有大量的组成成分，这些成分子啊这些区室的浓度能够保持几个小时到数天。荧光恢复漂白术表明这些无膜的细胞器在不断地与周围的物质进行交换。这些区室也会表现出一些不同的行为，比如说两个相同的液滴碰撞后就会融合到一起。到目前为止，从物理和分子的角度如何来解释这种无膜细胞器的性质还有待进一步的阐明。
一个重要的线索来理解这种无膜细胞区室的特点的研究是来自秀丽隐杆线虫的生殖细胞中的P granule的观察。，P颗粒是一种无膜的细胞器包含很多的大拿壁纸和RNA，相比于大多数的细胞器(200-1000nm)，它的尺寸在2-4um，使得能够定量的分析他们的形成，P颗粒之间彼此相互融合，随后形成球形的形状。光漂白技术表明，P颗粒内部的蛋白质与外围细胞质中的成分进行快速的交换。至关重要的是，在剪切力作用下，P颗粒可以在其他结构的表面周围自由流动和变形，并发生裂变14。 这些观察结果共同表明，P颗粒是通过与周围细胞质进行液-液混合（相分离）而形成的液体（请参阅下一节）。相分离的 概念表明了P颗粒在细胞分裂的过程中如何进行不对称的分裂。并且我们发现在此类相分离结构与经典的分子聚集(比如核糖体的聚集和装配)的物理性质与功能不同。
P颗粒的研究以及其他的无膜细胞器(细胞核DNA损伤修复位点以及压力颗粒)也表现出液滴状的性质，聚焦相分离是无膜细胞器形成可能性的共有机制。如下文所述，相分离原理确实可以解释具有不同材料特性的此类结构的形成以及此类结构的复杂组织（例如，组织成小室）。相界的存在解释了分子如何在没有周围膜的细胞中集中在一个地方，但仍然提供了一个依赖于快速扩散的适合细胞生物化学的环境。相分离也提供了一个统一的原理，解释了从不同类型的分子形成无膜室。
无膜细胞器在物理性质上是多样化的，多维度的(膜相关的，可溶性的)，分子组成，亚细胞定位和功能。尽管研究了多年，无膜细胞器有多种名字，比如说细胞体，核体，无膜细胞器，颗粒，speckle和聚集物膜斑等。在此作者提出一个新的概念，生物聚集，它强调两种常见的结构特性。一是它们能够浓缩生物分子，二是它们能够构成了生物分子，独立于其他的性质。
我们把这个名字应用于膜相关结构和各种非膜结合的细胞器和颗粒，因为我们相信这些结构是通过类似的机制形成的。这个术语还提供了一个与凝聚态物理中的概念的链接，正如我们在下面讨论的，这些概念对于理解这些结构的形成很重要。
多价驱动的相分离
分子将会混溶直到它们达到溶解限制，达到这个浓度阈值浓度，它们将会发生相分离，这种行为可以用经典的热动力学来解释，在细胞内，相分离的存在维持了不同化学反应区室之间的化学平衡通过它们之间的分子运动。
生物聚集里经常富集多种多价的分子。也就是拥有多种元素能够控制分子内以及分子间的互作。这种多重价之所以重要，是因为高分子科学中的经典概念表明多价分子自然组装混合时会变成大的低聚物或聚合物。从本质上讲，任何改变关键成分的局部浓度（包括蛋白质表达，降解和定位变化）的机制都将影响缩合相的形成和总体积。
由于熵驱动的的效应，这种聚集将会降低分子的固有的溶解力，因此驱动相分离的发生。多家分子的相分离和组装对于生物聚集是一个重要的方式。这种概念带你能够被广泛用于多价分子的相分离行为。这些分子包括构成多种模块互作结构域的蛋白质以及包含有无序结构的蛋白质。RNA和蛋白质含有多种能够结合核酸和蛋白质的结构域，他们也能够经历相分离。
带有模式结构域的蛋白质的相分离
带有模式互作结构域的蛋白质的相分离有许多，研究的最早的就是信号通路分子Nck-N-WASP蛋白，这些蛋白质通过在Nephrin和Src的同源结构域SH2之间的酪氨酸的磷酸化相互作用，从而形成高度有序的寡聚物。这种现象可以产生相分离的液滴，也可以产生膜脂上的聚簇。类似的系统是一个控制T细胞肌动蛋白组织的系统。该系统包括激活T细胞（LAT）、生长因子受体结合蛋白2（GRB2）、GRB2相关衔接蛋白2（GADS）、七子体（SOS）和SH2结构域的76kDa白细胞蛋白（SLP76；也被称为LCP2），在体外和细胞内形成膜点状，以响应T细胞受体27的刺激。除这些信号系统外，P体成分mRNA去盖酶亚基2（DCP2）和mRNA去盖蛋白3（EDC3）的增强子（图2b）、核仁蛋白核磷蛋白（NPM1）（图2c）和突触后密度蛋白突触间隙和突触后密度蛋白95（PSD95）；也被称为DLG4）被证明通过折叠域的多价相互作用相分离。在这些情况下，相互作用是与含有无序区域的配体24，28，29。与重复的RNA寡核苷酸结合的结构域20。 还研究了包含与泛SUMO相互作用基序（polySIM）配体结合的泛素相关修饰小分子（SUMO）结构域（polySUMO蛋白）的多个重复的蛋白质30（图2a，右）。 这些分子的实验已经确定了化合价（即相互作用模块的数量）和相互作用模块之间的亲和力，这是控制相分离的关键参数。 更高的化合价和亲和力都促进组装成更大的结构，从而在较低浓度下实现相分离（图2j），并减少了相分离液滴中分子的动态重排20,26。
具有内在无序区的蛋白质的相分离。
含有大的内在无序区（idr）的蛋白质代表了第二类丰富的大分子，它们可以在生理条件下相分离33。IDRs缺乏明确的三维结构，但通常包含重复的序列元素，为多价弱粘附分子间相互作用提供了基础。
含IDR的蛋白质富含许多生物分子缩合物，特别是那些也能浓缩RNA的蛋白质，如P体、应激颗粒、生殖颗粒和许多核结构。许多这样的蛋白质可以在不同的溶液条件下在体外自行相分离23，34-37。这些蛋白的idr具有较低的序列复杂度，并且富含数量有限的氨基酸类型-主要是甘氨酸、丝氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、苯丙氨酸和酪氨酸。一些idr还富含带电残基-赖氨酸、精氨酸、谷氨酸和天冬氨酸。缺乏序列多样性会在这些分子中产生多个Gly/Ser-Phe/Tyr-Gly/Ser序列和/或poly-Gln和poly-Asn束，以及正负电荷21、23、38-41的阻滞。这些重复的基序对于它们靶向RNA颗粒38-41或有丝分裂纺锤体42以及在体外和细胞内的相分离是重要的。
最近的一些研究指出，芳香残基在使idr相分离的相互作用中起着特别重要的作用（图2e）。例如，死盒螺旋酶4（DDX4）中的IDR含有许多苯丙氨酸重复序列，其芳香环似乎通过与Arg残基在分子内和分子间23以及可能在π堆积相互作用中进行阳离子π相互作用来促进相分离。同样，BuGZ（也称为ZNF207）和nephrin胞内结构域（NICD）中芳香残基的突变降低了这些蛋白质的相分离能力42,44。富含Gln、Asn或Ser残基的序列通过其侧链45、46的偶极相互作用也有助于相分离的驱动力。最后，含IDR蛋白质的相分离也可以通过在两种不同分子类型（图2f）之间或作为相同分子类型16、17、23、34、44（图2g）中的交替块的带相反电荷残基块之间的相互作用来促进。在这些系统中，带电物质的模式化是很重要的：对于相同的净分子电荷，当电荷均匀分布时，不利于相分离，而当电荷残基聚集时，促进相分离23、33、44、47。
值得注意的是，所有这些相互作用类型（芳族，极性和电荷）都是短暂的，并且肽链的结构顺序很少，这与相分离液体的动态性质一致。除了这些侧侧链的互作外包含有IDR序列的蛋白质骨架之间也存在互作。来自FUS，TAF15还有hnRNPA2和EWS能够有道RNA结合蛋白从固体杨水凝胶中析出来。这些水凝胶包含有纤维状的结构，他们在β折叠链中能够产生互作，这表明β链能够驱动纤维以及水凝胶的形成，这种弱的相互作用力很可能驱动液液相分离的发生。
对于任何的IDR，侧链以及骨架的互作对于相分离的贡献取决于蛋白质氨基酸的组成和序列模式。
相分离阈值的调控
通过改变分子的装配程度也可以改变相分离的阈值从而来调控 生物聚合的发生。
PTM，翻译后修饰过程对于实现此类调控是一个重要的过程，这类修饰通常能够改变生物聚合物成分的内在溶解度和化学价
比如在nephrin和LAT信号复合物中pTyr的数目越多，越能促进相分离的发生，使得通过操纵磷酸酶和磷酸激酶的活性来调控相分离的发生。20，26，27。nuage蛋白的DDX4的精氨酸修饰能够阻止相分离的发生，这种修饰能够降低降低阳离子和pi键之间的互作。此外PML核体的数目和结构受PML蛋白的SUMO化的修饰的影响，它们能够通过自身的SIM序列进行聚集。类似的，互作伙伴如RNA的结合能够增强蛋白质的溶解能力。当RNA存在的时候，P颗粒的成分PGL-3在体外的相分离的能力降低换句话说，在这种情况下，低浓度下，PGL-3能够发生相分离。在RNA存在的条件下，与RNA竞争性结合PGL-3的其他蛋白质的存在能够增加PGL的溶解限度。
成分的调节
基于IDR的相分离成分能够选择性的招募分子，在某些情况下，可以类似于基于域的系统来理解这种影响。举个例子，降低hnRNPA2和FUS中的Gly/Ser-Phe/Tyr-Gly/Ser的含量能降低它们在体外聚集IDR的效力。
物理性质的调控是一个能量消耗的过程
细胞可能具有限制IDR趋于成熟的机制，以便将凝析液的动态特性和类似液体的特性调整为适合功能的状态。其中一个可能的机制就是在聚缩的过程中，存在能量以来的机制去控制聚合物的形成和铰链。有研究表明，在RNA guranel中，存在分子伴侣(ATP依赖性的解聚酶)以及分子马达。确实ATP的耗尽，将会将会降低核体和压力颗粒的粘度。此外，几种ATPase可以调节应激颗粒的动力学，增加或减少其持久性50,52。近来，已经提出IDR形成纤维的热力学驱动与相对的解聚酶机制之间的不平衡可能导致疾病。 实际上，大量数据都将含有RNA的凝结物的失调与神经退行性疾病联系起来。
除了能量的使用情况会影响聚集物的形成，其他的因素，比如肌动蛋白骨架也能够影响相分离颗粒的形成和定位。
多相生物分子聚集物
最近的一项研究详细检查了该过程中的核仁，并证明该小室具有不同的粘度，表面张力和组成71。 相的不同表面张力使一个小室被另一小室包封，这是由于基于IDR或组分折叠域的明显多价相互作用而引起的。 如何调节这种多相冷凝物的组成以及如何在细胞中引发这种结构的组装仍然是个悬而未决的问题。
不同的子隔间根据其组成可能具有不同的成熟倾向。例如，核仁的（内部）致密的纤维状子小室比（外部）颗粒状组分更易于成熟，并且在细胞中可能表现出一系列的粘弹性行为，这很可能受到调节[13,71]。如其名称所示，这些小隔间的电子显微镜图像显示出明显的纹理94。同样，Cajal体有时会呈现出螺旋状的结构，可以通过电子显微镜23、43、95进行观察，而在其他时候则表现出各向同性。这些盘绕的元件可以代表嵌入较大液相中的纤维结构。最近的生化和高分辨率成像研究表明，其他冷凝物也含有表现为固体的亚结构13、52、92、93。尽管这些小室的功能尚待确定，但似乎细胞会调节固体与液体材料的相对量，以产生功能性作用，例如调节反应动力学或抵抗机械力稳定结构（请参见下文）。
生物聚集对于反应动力学的影响
生物聚缩过程极大的增加化学反应的局部浓度，最简单的情况下，浓度的增加能够增加结构内部的反应速率，但值得主义的是这种情况是在反应物和第五同时浓缩到同一个相体系才会发生。举个例子，组蛋白的mRNA的处理过程显著的降低，当重要的反应成分没有在组蛋白局部体进行聚集的时候。
总结和展望
过去几年的研究在理解构成生物分子缩合物的形成，调控和功能的分子机理上取得了重大进展。 在多价分子相互作用的驱动下，许多这些结构似乎是通过液相分离形成的。 这种机制自然导致控制冷凝物的组装和拆卸，组成和物理性质的途径。 这些途径反过来对其中发生的生物化学及其细胞功能产生影响。
既然细胞可以通过相分离形成间隔，为什么细胞需要细胞内膜呢？由于冷凝液的局部环境由于基因表达和分子转换的波动而不断变化，因此膜结合腔室可以提供长期稳定性，而冷凝液可能难以维持这种稳定性。例如，正在进行的稳态反应需要从细胞质中长期分离出来。除了长期储存，细胞毒性反应需要在结构上保持分离，以保护周围细胞质或核质的完整性。最后，非常小的分子，如离子，将很难保留在冷凝液中。例如，没有膜就不能稳定地维持pH梯度。因此，这两种组织细胞的方法-膜或相分离-是复杂的，并允许最大可能的组织细胞内容物。
通过相分离和多价组装产生冷凝物的观点是否对疾病有影响，并且这种知识能否带来新的临床机会？ 现有数据表明，凝结物可能遍布连续的物质和组成状态。 而且，这种自然谱中的像差与神经变性有关，其中一些可能涉及纤维形成的失调。 这些畸变如何影响细胞生理？ 这种情况可能只是对生物分子缩合物的机械理解可能具有医学意义的众多实例之一。
最后，相分离还可以组织其他哪些细胞结构？ 原则上，由多价实体之间的相互作用组成的任何系统都倾向于在适当的溶剂条件下发生相分离。 染色质生物学是细胞生物学中一个有趣的领域，富含多价相互作用。 染色质可视为核糖体的长阵列，这些核糖体在其组成组蛋白上修饰有特定标记。 这些标记由特定的模块化结构域读取，这些结构域也经常出现在染色质结合蛋白的多价阵列中。 因此，似乎有理由能够推断出修饰的核小体和组蛋白尾巴阅读器可能会发生相分离，并且这一过程可能会影响染色质的组织和功能。
解决这些问题很可能需要新技术和新概念方法，并要利用从遗传学到生物化学再到物理学的学科。 这些问题的答案有望解释纳米级分子如何引起微米级细胞组织以及该组织在生物学中的功能。
