記事标题：代謝物非対称ジメチルアルギニン（ADMA）は、変形性関節症においてDDAH1を介したSOX9の不安定化促進剤として機能する
出版雑誌: Science Advances
インパクトファクター: 14.95
著者の所属: 浙江大学医学部付属潤潤沙病院
Baiqu が提供するサービス: iTRAQ/TMT マーカー定量プロテオミクス
研究の背景
変形性関節症 (OA) は、一連の代謝変化と酵素変化を伴う変性疾患です。この研究では、変性軟骨細胞ではジメチルアルギニン ジメチルアミノヒドロラーゼ-1 (DDAH1) の下方制御に非対称ジメチルアルギニン (ADMA) が伴い、OA サンプルが増加することを報告しています。軟骨細胞における ADMA 加水分解酵素 DDAH1 の全体的または条件的ノックアウトは、マウスの OA の発症を促進します。ADMA は軟骨細胞の変性と老化を誘導し、細胞外マトリックスの沈着を減少させるため、OA の進行を加速します。ADMA は SOX9 とその脱ユビキチン化酵素 USP7 に同時に結合し、USP7 による SOX9 の脱ユビキチン化をブロックし、それによって SOX9 の分解を引き起こします。OA 患者の滑液中の ADMA レベルは上昇しており、OA の診断に対して良好な感度と特異性の予測値を持っています。したがって、DDAH1 を活性化して ADMA レベルを低下させることは、OA 治療の潜在的な治療戦略となる可能性があります。
テクニカルルート
研究結果
01 変形性関節症における軟骨細胞内の ADMA の上昇は軟骨変性を引き起こす
メタボロミクス分析が 6 人の OA 患者と 6 人の比較的健康な患者 (膝骨折、OA の病歴なし) に対して行われたところ、2 つのグループ間で一連の代謝産物の違いが現れました。TOP25 を上方制御した代謝産物の中で、ADMA は最も高い統計的有意性を持ち、その異性体である対称ジメチルアルギニン (SDMA) は実質的に変化しませんでした (図 1B)。ADMA が in vivo で OA を誘発するかどうかを調べるために、著者らは内側半月板 (DMM) の不安定化手術の 1 週間後にマウスの膝関節に ADMA を直接注射しました。ADMA は、DMM 手術中に軟骨変性を著しく促進し、骨棘の形成を促進しました。さらに、免疫組織化学的染色により、ADMA に曝露された軟骨における II 型コラーゲンとアグリンの発現の減少が確認されました。ホットプレートアッセイ、ロータロッド実験、および野外実験により、ADMAを注射したマウスは疼痛閾値と可動性が大幅に低いことが明らかになりました。総合すると、これらのデータは、変性軟骨細胞における ADMA の増加が軟骨の変性と老化を引き起こすことを示唆しています。
02 DDAH1 の下方制御は OA 患者における ADMA の上昇を引き起こす
ADMA はアルギニンとメチル化残基のタンパク質分解中に放出され、その後 DDAH ファミリーまたは AGXT2 によって加水分解されます。著者らは、OA における DDAH1 の役割を調査するために DDAH1 阻害剤 PD 404182 を使用しました。結果は、ADMA が PD 404182 処理軟骨細胞で急激に上昇していることを示しました (図 1C)。さらに、ADMAはDDAH1-/-（DDAH1全ノックアウトマウス）初代軟骨細胞で上昇した（図1D）。これらのデータは、OA の進行において DDAH1 が抑制され、それによって軟骨細胞内の ADMA レベルが増加することを示唆しています。さらに、ウェスタンブロッティングおよび免疫組織化学により、DDAH1 の喪失が確認されました (図 1H)。マイクロマス培養および３Ｄアガロース培養は、ＤＤＡＨ１−／−初代軟骨細胞におけるＥＣＭ沈着の低下を示した（図１Ｅ、Ｆ）。20週齢のDDAH1-/-マウスでは明らかなOA関連表現型は観察されなかったが、DDAH1欠失はDMM誘発OAマウスの軟骨変性を有意に加速した（図1G）。免疫組織化学により、DDAH1-/- マウスの軟骨では II 型コラーゲンと凝集タンパク質が減少していることが示され (図 1H)、ADMA が DDAH1 の作用下で急速に加水分解できることが確認されました。
図 1. DDAH1 による ADMA の上方制御により OA プロセスが加速される
03 軟骨特異的DDAH1は変形性関節症の進行に関与する
DDAH1の役割をさらに研究するために、著者らはDDAH1fl/flのマウスモデル（DDAH1コンディショナルノックアウトマウス）を確立し、ADMAが軟骨細胞で高度に発現していることを発見した。RT-PCRの結果、同化因子（COL2A1およびACAN）が減少し、異化因子（MMP3およびMMP13）が増加したことが示されました（図2A）；さらに、アグリカンおよびCOL2A1のタンパク質発現は、DDAH1欠失後に有意に下方制御されました（図2B）。 。骨に対するDDAH1の影響を排除するために、著者らはCol2-CreERT2およびACAN-CreERT2マウスを使用してDDAH1コンディショナルノックアウトマウスを作製し、その結果、軟骨細胞においてDDAH1遺伝子がコンディショナルに欠失した。軟骨における DDAH1 の欠失により、対照と比較して、DMM 手術後により重篤な軟骨損傷が生じました (図 2C)。さらに、DDAH1fl/fl、Col2-CreERT2およびDDAH1fl/fl、ACAN-CreERT2マウスの軟骨では、II型コラーゲンおよび凝集タンパク質の発現が大幅に減少しました（図2D）。
一方、DDAH1fl/fl、Col2-CreERT2 マウスおよび DDAH1fl/fl、ACAN-CreERT2 マウスでは、より多くの骨棘が観察されました (図 2E)。著者らは軟骨下骨密度も調査し、DDAH1fl/fl, Col2-CreERT2 マウスと DDAH1fl/fl, ACANCreERT2 マウスの両方がより高い軟骨下骨量を示すことを発見しました (図 2F)。ホット プレート、ロータロッド、およびフィールド実験により、DDAH1fl/fl、Col2-CreERT2 および DDAH1fl/fl、ACAN-CreERT2 マウスは痛みに対してより敏感であり、ある程度の運動障害があることが示されました (図 2G)。LC-MS により、DDAH1 過剰発現軟骨細胞における ADMA レベルの低下が確認されました。これは、DDAH1 がマウスの DMM 誘発性変形性関節症を部分的に回復できることを示しています。
図 2. DDAH1 の特異的ノックアウトは OA の発症を促進する
04ADMAはSOX9のユビキチン-プロテオソーム経路を活性化します
内因性の一酸化窒素シンターゼ阻害剤として、ADMA は NO を介して病態生理学的プロセスに影響を与える可能性があり、ADMA 誘発性の軟骨細胞変性が NOS/NO 経路に依存しないことが実験で証明されています。ADMA 誘発性軟骨細胞変性のメカニズムをより深く理解するために、著者らは ADMA 処理細胞 (Shanghai Baiqu Biotech 提供) に対して TMT 定量的プロテオミクス研究を実施しました。KEGG分析により、ECM受容体相互作用、TNFシグナル伝達経路、細胞老化、グリコサミノグリカン生合成など、いくつかの濃縮されたOA関連経路が明らかになりました（図3A）。
火山プロットでは、異化因子 (MMP3 および MMP13)、老化マーカー (P21)、炎症性ケモカイン (CCL2、CCL5、および CXCL10) の上方制御、および同化因子 (アグリカン、COL2A1、および SOX9) の下方制御が示されました (図 3B)。以前の研究では、SOX9欠乏が健康な軟骨プロテオグリカンの損失を引き起こし、外傷性OA後の重度の軟骨びらんの一因となることが示されました。著者らは次に、SOX9がADMAの影響を受ける中心的なタンパク質であるかどうかに焦点を当てた。RT-PCRにより、DDAH1の欠失はSOX9 RNAレベルを有意に変化させないことが明らかになった(図3C)。しかし、ADMA または DDAH1 欠失にさらされた軟骨細胞では、SOX9 タンパク質の発現が大幅に下方制御されました (図 3D および 3E)。
さらに、免疫組織化学により、PD 404182（図3F）またはDDAH1fl/fl、Col2-CreERT2およびDDAH1fl/fl、ACAN-CreERT2マウス（図3G、h）を注射されたマウスの軟骨においてSOX9の発現が劇的に減少することが示された。 ）。さらに、ADMA に曝露された細胞では、SOX9 の半減期が対照細胞よりも短く、ADMA が SOX9 の不安定化を引き起こすことが示唆されました。MG132(プロテアソーム阻害剤)処理はSOX9分解を阻害したが、クロロキン(リソソーム阻害剤)は阻害しなかったことから、SOX9分解がリソソーム経路ではなくプロテアソーム経路に依存していることが示唆された(図3I、J)。さらに、ADMA 誘発 SOX9 分解は、DDAH1 過剰発現軟骨細胞では部分的に逆転しました (図 3K)。注目すべきことに、ADMA はユビキチン化 SOX9 のレベルを増加させました (図 3L)。結論として、ADMA はユビキチン - プロテアソーム経路を通じて SOX9 分解を引き起こします。
図 3. ADMA はユビキチン - プロテアソーム経路を通じて SOX9 分解を誘導します
05ADMA は SOX9 と USP7 間の相互作用をブロックします
ADMA がユビキチン - プロテアソーム経路を通じて SOX9 分解を加速することを実証した後、著者らは次に、ADMA が SOX9 レベルにどのような影響を与えるかを決定することを目的としました。著者は、ビオチン-ADMAを合成し、軟骨細胞培地で培養し、質量分析で検出し、UbiBrowserデータベースと組み合わせることで、SOX9関連E3ユビキチンリガーゼまたは脱ユビキチン化酵素（DUB）間の特異的相互作用を予測した。 USP7は、作用するタンパク質に関与している可能性があります（図4A、B）。免疫沈降の結果は、USP7 がユビキチン化 SOX9 を還元できることを示しました。USP7 と ADMA の間の相互作用はウェスタンブロッティングによって検証されました。質量分析の結果は、ADMA が SOX9 と相互作用することを示し、これはウェスタンブロッティングによってさらに確認されました。
次に、ADMA がこれら 2 つのタンパク質に直接結合するかどうかをさらに調べるために、一連の分子実験の結果、ADMA が主にそれらの結合を防ぐために、SOX9 と USP7 の間の相互作用領域に結合できることが示されました。免疫共沈降により、SOX9 と USP7 の間の相互作用が確認され、ADMA によって弱められました (図 4C ～ J)。推測の正確さを確認するために、USP7 を阻害した後、ADMA は SOX9 の発現と SOX9 のユビキチン化に影響を与えませんでした。これらの結果は、ADMA が SOX9 上の USP7 の脱ユビキチン化をブロックすることを裏付けています。
図 4. ADMA は SOX9 と USP7 間の相互作用をブロックします
06 滑液中のADMAはOAの診断マーカーとなる可能性がある
ADMA がヒトの滑液中で増加するかどうかを調べるために、著者らは遡及研究を実施しました (図 5A)。包含基準によれば、350 人の OA 患者 (センター 1 で n = 114、センター 2 で n = 112、センター 3 で n = 124) が含まれ、Kellgren-Lawrence (KL) に従って軽度、中等度、重度に分類されました。分類は3段階（図5B）。OA が加齢に伴う変性疾患であることを考慮すると、3 つの段階の患者には性別、身長、体重、BMI に有意差はありませんでしたが、年齢にはわずかな差がありました (図 5C)。
予想通り、比較的健康な患者と比較して、OA 患者は滑液中の ADMA の大幅な増加を示しましたが、SDMA は臨床的に有意ではないようでした。重度の OA 患者の滑液中の ADMA レベルは、中等度の OA 患者の滑液中の ADMA レベルよりも有意に高く (図 5D)、ADMA が OA の進行と正の相関がある可能性があることを示唆しています。ピアソン相関分析によると、滑液中の ADMA は、膝協会スコア (膝 OA の臨床評価スコア) (図 5E) および最小内側関節腔幅 (関節腔の狭小化と関節腔の X 線測定の重要な尺度) とよく相関していました。 OA の評価)、負の相関関係があります (図 5F)。さらに、ADMA は、BMI とは無関係に、年齢とわずかに正の相関がありました (図 5G、H)。受信者動作特性（ROC）曲線は、滑液ADMAがOA患者と比較的健康な患者を区別できることを示しており、これは良好な感度と特異性でOAの早期診断に有益であるが、進行性OAと早期OAを区別することはできない（図5I）。 ）。これらのデータは、滑液中のADMAがOA診断の潜在的なマーカーである可能性を示唆しています。
図 5. ヒト滑液における ADMA の変化の結果
要約する
今回、研究チームは、変性軟骨細胞において新しいバイオマーカーであるADMAを同定し、ADMAの増加はDDAH1の下方制御を伴ったことを発見した。DDAH1 の制御下で、ADMA は軟骨細胞と軟骨の変性と老化を促進し、それによって NOS/NO 経路とは独立して OA の進行を加速します。対照的に、ADMA は SOX9 と USP7 に直接結合し、それらの相互作用領域をブロックし、ユビキチン - プロテアソーム経路を介して SOX9 の分解を促進します。したがって、DDAH1 を標的とすることは、OA 治療に新たな方向性を与える可能性があります。