题目：Peptidomics analysis of milk protein-derived peptides released over time in the preterm infant stomach
期刊：Journal of Proteome Research
发表时间：March 14, 2019
DOI：10.1021/acs.jproteome.8b00604
作者及单位：
Robert L. Beverly--Nutrition Program, School of Biological and Population Health Sciences, College of Public Health and Human Sciences, Oregon State University, Corvallis, USA；
Mark A. Underwood--Department of Pediatrics, University of California, Davis, Sacramento，USA；
David C. Dallas--Nutrition Program, School of Biological and Population Health Sciences, College of Public Health and Human Sciences, Oregon State University, Corvallis, USA；
分享人：陈凌云
概述：母乳是婴儿的重要营养来源，它包含了婴儿生长和发育所需的大量营养素、微量营养素以及其它生物活性因子等。母乳蛋白可提供蛋白质合成所需的氨基酸，完整的母乳蛋白对婴儿有多种作用，如支持婴儿的免疫系统、阻止病原菌的生长、作为生长因子以及调控铁的吸收和运输等。此外，母乳蛋白经消化水解后产生的多肽也具有某些特殊的生物活性，如抗微生物、抗高血压、免疫调控和抗炎症等。因此，母乳蛋白在婴儿发育中的作用不仅局限于完整蛋白的功能和提供氨基酸，也包含了产生具有功能的生物活性多肽。
母乳自身含有的蛋白酶和婴儿消化系统中的蛋白酶均能将母乳蛋白水解成具有潜在生物活性的多肽。在本文中，该团队招募了14名早产儿，9名早产儿喂养母乳并加添加剂（主要为无脂肪牛乳），5名早产儿仅喂养母乳不加添加剂。然后收集喂养的母乳以及婴儿被喂养后1、2和3小时的胃部内容物，对收集的样本进行多肽提取、质谱检测及肽段鉴定和分析。
实验结果：
本文中质谱数据是通过Orbitrap Fusion Lumos进行检测产生，56个样本共鉴定到11,592个unique peptides，来源于299个蛋白，其中8,037个人unique peptides来源于202个人母乳蛋白，3,340个牛乳unique peptides来源于97个添加剂牛乳蛋白，还有251个肽段在人乳和牛乳中均存在。大部分检测鉴定到的肽段（8,747）均不存在于原始喂养母乳中，而是至少存在于采集胃部消化物的一个时间点的样本中（图1）。经过统计得出，从原始母乳到胃部消化1、2、3小时后采集的胃部内容物样本中，鉴定到的肽段丰度和数目呈现连续增加的趋势（图2A,2B）。另外，分析在原始母乳和3小时后胃部内容物中鉴定到的肽段，发现更多的肽段在原始母乳中的丰度显著高于消化三小时后胃部内容物（图2C）。
图1. 原始母乳以及不同时间胃部内容物样本中鉴定到的unique peptides韦恩图；
图2. 原始母乳与喂养1、2、3h后收集胃部内容物样本的总肽段丰度（A）和数目（B）的箱线图；（C）、3小时后收集的胃内容物中肽段与母乳中肽段响应的fold change与FDR矫正p值间的火山图；
早产儿的母乳中常常需要添加额外的乳汁蛋白（牛乳蛋白）为婴儿的生长提供所需的蛋白质。为了确定母乳中添加牛乳添加剂是否对婴儿消化母乳过程中肽段的产生造成影响，通过比较喂养母乳加添加剂组与无添加剂仅喂母乳组的样本发现，母乳无添加剂组的肽段丰度和数目均显著高于母乳加添加剂组（图3A,3B）。另外统计了来源于母乳中5个高丰度蛋白的肽段丰度和数目，发现添加剂组中β-酪蛋白、as1-酪蛋白、骨桥蛋白来源的肽段数目和丰度显著低于无添加剂组，来源于多聚免疫球蛋白的肽段数目低于无添加剂组，仅来源于乳铁传递蛋白的肽段在两组中无明显差异（图4A,4B）。
图3. 比较喂养母乳加和不加添加剂组不同收集时间的胃部内容物所有样本中以及原始母乳中总鉴定肽段的平均相对丰度（A）和数目（B）
图4. 比较喂养母乳加和不加添加剂组不同收集时间的胃部内容物所有样本中和母乳中总鉴定肽段平均相对丰度（A）和数目（B），按照5个高丰度母乳蛋白进行分组；
生物活性肽段往往具有对肠细胞以及在肠道内抵抗细菌等作用。通过同源性搜索，本文鉴定到的肽段中92个unique peptides是已知的生物活性肽段，678条肽段的序列同源性大于80%。 统计发现生物活性肽段的平均丰度和数目也是从原始母乳到胃部消化1、2、3h后的内容物中呈显著增加的趋势（图5A,5B）。生物活性肽是否在胃中比非生物活性肽更易被留下，770条同源肽段中，有153条至少在一个样本中的所有采集点均出现。同源肽段氨基段组成和未被水解的肽段具有更高的相似性（图6A），未被水解的肽段中F, L, M, P, Q, V, W和 Y氨基酸的比例显著高于被水解的肽段，就氨基酸的组成来看，生物活性肽段的翻译后修饰概率与未被水解的肽段更类似（图6B）。另外为了分析肽段未被降解的原因，检查了来源于人母乳中最高丰度的3个蛋白，β-酪蛋白、as1-酪蛋白、乳铁传递蛋白随消化时间产生肽段的丰度（图7A,B,C）情况，发现了若干个产生高丰度肽段的区域。
图5. 原始母乳与喂养1、2、3h后收集胃部内容物样本中具有生物活性肽段的丰度（A）和数目（B）；
图6. 未被水解、水解以及生物活性肽段的氨基酸的组成（A）和翻译后修饰肽段的比例（B）；
图7. 人母乳中β-酪蛋白、as1-酪蛋白、乳铁传递蛋白产生的肽段丰度；
本文对收集的早产儿喂养含添加剂母乳和不含添加剂母乳后不同时间胃内容物的样本和原始母乳样本进行多肽的丰度和数目比较，并通过与已知生物活性的母乳肽段进行序列比对分析，同时对鉴定到的肽段进行了生物活性预测，也首次提供了母乳在早产儿胃部消化过程中不同阶段被水解后产生的多肽组的profile。