简介
USEARCH是最好用的扩增子分析软件，但是代码不开源，可分析大数据的64位版收费，阻止了很多经费有限小伙伴的学习和使用。
因此VSEARCH因时而生，免费、开源，让大家分析扩增子即方便，又免费，同时算法公开透明。更多介绍见下文链接：
vsearch主要功能有 - 嵌合体检测、聚类、去冗余、添加重复、fa/fq文件处理、masking、两两比对、搜索、重排、排序、抽样、物种分类(宏基因组、基因组和群体遗传)等。
此软件从14年11月28日发布v1.0.0以来，目前已经更新了89个版本，最新版于18年6月22号更新v2.8.1。主页：https://github.com/torognes/vsearch，
拥有主流操作系统Windows/Mac/Linux的各种版本，方便跨平台使用。
18年7月28日，最新版仍为 2.8.1 (180622)
以Windows版本为例，下面是下载链接
https://github.com/torognes/vsearch/releases/download/v2.8.1/vsearch-2.8.1-win-x86_64.zip
里面有程序文件，还有帮助文档。
主要功能和命令行格式
嵌合体检测
Chimera detection:
序列自身比对去嵌合
vsearch (–uchime_denovo | –uchime2_denovo | –uchime3_denovo) fastafile (–chimeras |
–nonchimeras | –uchimealns | –uchimeout) outputfile [options]
常用最新的uchime3进行denovo去嵌合，–nonchimeras指定输出过滤后的结果
基于参考数据库去嵌合
vsearch –uchime_ref fastafile (–chimeras | –nonchimeras | –uchimealns | –uchimeout) outputfile
–db fastafile [options]
再使用uchime_ref进行有参去嵌合体，数据库推荐使用又大又全的SILVA最新版本。同时推荐不要基于参考序列去嵌合，因为亲本缺少丰度信息情况下，容易造成假阴性。而de novo去嵌合时，要求亲本的丰度至少是嵌合体的16倍以上，这样可以较少控制假阴性率。
聚类
Clustering:
vsearch (–cluster_fast | –cluster_size | –cluster_smallmem | –cluster_unoise) fastafile (–alnout |
–biomout | –blast6out | –centroids | –clusters | –mothur_shared_out | –msaout | –otutabout |
–profile | –samout | –uc | –userout) outputfile –id real [options]
按丰度高到低聚类选择cluster_fast，非聚类的精度序列变异选择cluster_unoise算法。
去冗余
Dereplication and rereplication:
vsearch (–derep_fulllength | –derep_prefix) fastafile (–output | –uc) outputfile [options]
vsearch –rereplicate fastafile –output outputfile [options]
合并序列采用derep_fulllength去冗余，非冗余序列名中包括测序获得非冗余序列的次数(count值)
序列操作
FASTA/FASTQ file processing:
质量评估
vsearch –fastq_chars fastqfile [options]
格式转换
如phred64 - phred33
vsearch –fastq_convert fastqfile –fastqout outputfile [options]
质量统计
vsearch (–fastq_eestats | –fastq_eestats2) fastqfile –output outputfile [options]
质量控制
vsearch –fastq_filter fastqfile (–fastaout | –fastaout_discarded | –fastqout | –fastqout_discarded)
outputfile [options]
双端序列合并
vsearch –fastq_mergepairs fastqfile –reverse fastqfile (–fastaout | –fastqout | –fastaout_notmerged_fwd | –fastaout_notmerged_rev | –fastqout_notmerged_fwd | –fastqout_notmerged_rev |–eetabbedout) outputfile [options]
双端序列合并，左端为默认参数，–reverse为右端文件, –fastqout指定输出文件，–fastaout_notmerged_fwd, –fastaout_notmerged_rev,可输出末匹配的结果，–eetabbedout输出统计至文件，–fastq_truncqual可移除3‘端低质量区。–fastq_minlen可过滤短序列，默认1。–fastq_maxns过滤N序列，默认不限制。默认不允许Overhang，除非使用–fastq_allowmergestagger。最小重叠区–fastq_minovlen默认为10，序列过长可调小。–fastq_maxdiffs设置重叠区数，默认最大10，–fastq_maxdiffpct可设置错配比例，默认为100%。扩增子有切胶回收目的片段的产物，已知情况下可按最大、最小长度过滤，–fastq_minmergelen and –fastq_maxmergelen。其它的参数还有–fastq_ascii, –fastq_maxee, –fastq_nostagger, –fastq_qmax, –fastq_qmaxout, –fastq_qmin, –fastq_qminout, and –label_suffix
序列统计
vsearch –fastq_stats fastqfile [–log logfile] [options]
序列取反向互补
vsearch –fastx_revcomp fastxfile (–fastaout | –fastqout) outputfile [options]
屏蔽序列
Masking:
Fasta/q文件屏蔽低复杂序列
vsearch –fastx_mask fastxfile (–fastaout | –fastqout) outputfile [options]
Fasta文件屏蔽低复杂序列
vsearch –maskfasta fastafile –output outputfile [options]
两两比对
Pairwise alignment:
序列自身两两全局比对
vsearch –allpairs_global fastafile (–alnout | –blast6out | –matched | –notmatched | –samout |
–uc | –userout) outputfile (–acceptall | –id real) [options]
搜索
Searching:
搜索序列完全一致结果
vsearch –search_exact fastafile –db fastafile (–alnout | –biomout | –blast6out |
–mothur_shared_out | –otutabout | –samout | –uc | –userout) outputfile [options]
全局比对，用于生成OTU表
vsearch –usearch_global fastafile –db fastafile (–alnout | –biomout | –blast6out |
–mothur_shared_out | –otutabout | –samout | –uc | –userout) outputfile –id real [options]
重排与排序
Shuffling and sorting:
序列洗牌、按长度排序、排丰度排序
vsearch (–shuffle | –sortbylength | –sortbysize) fastafile –output outputfile [options]
抽样
Subsampling:
fastq/a文件抽样
vsearch –fastx_subsample fastafile (–fastaout | –fastqout) outputfile (–sample_pct real | –sample_
size N) [options]
物种分类
Taxonomic classification:
sintax算法物种注释
vsearch –sintax fastafile –db fastafile –tabbedout outputfile [–sintax_cutoff real] [options]
处理UDB数据库索引
UDB database handling:
比对数据库建索引
可节约每次建索引时间
vsearch –makeudb_usearch fastafile –output outputfile [options]
转换索引为fasta序列文件
vsearch –udb2fasta udbfile –output outputfile [options]
索引文件统计
vsearch (–udbinfo | –udbstats) udbfile [options]
描述
vsearch主要用途是扩增子分析过程中的序列处理，包括序列质控、去冗余、聚类、去嵌合、生成OTUs表等
输入
输入文件为标准的fasta或fastq格式；
当序列名中存在整数时，会作为丰度用于输助嵌合体检测、OTU聚类/去噪代表性序列选择；
文件中字母大小写是有意义的，正常为大写，小写为软屏蔽(soft masking)
输入文件支持管道操作，用-代替管道的输入文件，实现多命令连用
支持gzip或bzip2压缩文件，在管道中来的压缩文件需要加参数--gzip_decompress
参数
通用参数
| 参数 | 描述 |
|---|---|
| –bzip2_decompress | 当管道流入bzip2压缩格式时使用，直接读取压缩文件时不需要 |
| –fasta_width | 输出fasta格式默认为80个nt一行，参数可设置输出fasta列宽 |
| –gzip_decompress | 当管道流入gzip压缩格式时使用，直接读取压缩文件时不需要 |
| –help或-h | 显示帮助并退出 |
| –log filename | 日志写入文件 |
| –maxseqlength N | 最大序列长度，默认长度>50000将丢弃 |
| –minseqlength N | 最小序列长度，排序和洗牌时默认为1，聚类、去冗余或搜索时为32 |
| –no_progress | 不显示运行进度 |
| –notrunclabels | 保留完整序列名，默认去掉空格或制表符后面的信息 |
| –quiet | 除警告或致命错误，其它标准输出和标准误信息不输出 |
| –threads N | 计算使用的线程数，范围1-256。要<=CPU核数，默认使用全部。支持多线程命令有allpairs_global, cluster_fast, cluster_size, cluster_smallmem, fastq_mergepairs, maskfasta, search_exact, uchime_ref, and usearch_global |
| –version或-v | 输出版本信息并退出 |
嵌合体检测参数
| 参数 | 描述 |
|---|---|
| –abskew real | –uchime_denovo时，丰度比例用于检测谁是嵌合，谁是亲本。–uchime3_denovo默认值为16，其它时为2，即亲本是嵌合体2倍以上，必须大于1 |
| –alignwidth N | –uchimealns时，设置三路比对的宽度，默认为80，0为无限制 |
| –borderline 文件名 | 输出无法确定的嵌合体，它们像嵌合体，但不足以区分其和亲本 |
| –chimeras 文件名 | 输出嵌合体序列 |
| –db 文件名 | 使用–uchime_ref指定数据库fasta文件 |
| –dn real | No vote pseudo-count, corresponding to the parameter n in the chimera scoring function (default value is 1.4). |
| –fasta_score | 输出结果中包含嵌合体打分 |
| –mindiffs N | 每部分最小不同，默认3。–uchime2_denovo和–uchime3_denovo中此参数无效 |
| –mindiv real | 与亲本最小分歧，默认0.8，同上 |
| –minh real | 最小得分(h)，增大此值可减少假阳性、增加敏感性。默认0.28，范围0-1，同上 |
| –nonchimeras filename | 输出无嵌合体结果文件 |
| –relabel string | 序列重命名，–sizeout保留丰度注释 |
| –relabel_keep | 重命名时保留原始名称 |
| –relabel_md5 | 按序列md5值重命名 |
| –relabel_sha1 | 按序列sha1值重命名 |
| –self | -uchime_ref时，忽略原始和数据库中的同名序列 |
| –selfid | -uchime_ref时，忽略原始和数据库中完全相同的序列 |
| –sizeout | 输出文件添加丰度值 |
| –uchime_denovo filename | 序列按丰度排列，自身去嵌合，无需参考数据库，不支持多线程 |
| –uchime2_denovo filename | UCHIME2算法去嵌合，按丰度排序，类似扩增子去噪–cluster_unoise |
| –uchime3_denovo | 与uchime2类似，–abskew默认是16，而不是2 |
| –uchime_ref | 有参去嵌合 |
| –uchimealns | 输出嵌合体三路比较结果 |
| –uchimeout | 嵌合体比对详细 |
| –uchimeout5 | usearch5版本格式 |
| –xn real | No vote weight, corresponding to the parameter beta in the scoring function (default value is 8.0). |
| –xsize | 去除丰度值 |
聚类参数
vsearch采用单路、贪婪中心聚类算法。
| 参数 | 描述 |
|---|---|
| –biomout filename | 输出biom格式1.0的OTU表，JSON文件，详见http://biom-format.org/documentation/format_versions/biom-1.0.html |
| –centroids filename | 输出中心序列作为代表序列 |
| –clusterout_id | 当使用–consout和–profile时，添加簇的标志符信息 |
| –clusterout_sort | –consout, –msaout和–profile时，结果按丰度降序排列 |
| –cluster_fast | 按序列长度排序聚类 |
| **–cluster_siz**e | 按序列丰度排序聚类 |
| –cluster_smallmem | 省内存方式聚类，不按丰度排序，默认按长度，除排指定–usersort |
| –cluster_unoise | 采用unoise3算法去噪。–minsize默认值为8，–unoise_alpha默认值为2，完成后需要连用–uchime3_denovo |
| –clusters string | 输出结果为每条序列一个fasta文件 |
| –consout filename | 输出每个cluster比对的一致序列 |
| –cons_truncate | This command is ignored. A warning is issued. |
| –id real | 相似度阈值 |
| –iddef 01234 | 修改id的定义，0. CD-HIT definition: (matching columns) / (shortest sequence length).n1. edit distance: (matching columns) / (alignment length). 2. edit distance excluding terminal gaps (same as –id). 3. Marine Biological Lab definition counting each gap opening (internal or terminal) as a single mismatch, whether or not the gap was extended: 1.0 - [(mismatches + gap openings)/(longest sequence length)] 4. BLAST definition, equivalent to –iddef 1 in a context of global pairwise alignment. |
| –minsize N | –cluster_unoise最低丰度，默认8 |
| –msaout filename | 输出多序列比对 |
| –mothur_shared_out filename | mother格式OTU表 |
| –otutabout filename | 经典表格格式 OTU表 |
| –profile filename | 多序列比对频率谱文件 |
| –qmask none dust soft | 屏蔽序列的方法 |
| –relabel string | 序列重命名，–sizeout保留丰度注释 |
| –relabel_keep | 重命名时保留原始名称 |
| –relabel_md5 | 按序列md5值重命名 |
| –relabel_sha1 | 按序列sha1值重命名 |
| –sizein | 考虑序列的丰度注释，search for the pattern ’[>;]size=integer[;]’ in sequence headers |
| –sizeorder | 扩增子有多个可能中心时，考虑丰度优先 |
| –sizeout | 输出结果带丰度信息 |
| –strand plus或both | 默认只检测正链 |
| –uc filename | uclust结果格式 |
| –unoise_alpha real | 默认为2，–cluster_unoise命令的子参数 |
| –usersort | -cluster_smallmem下可指定序列顺序 |
| –xsize | 去除丰度信息 |
| 其它参数 | Most searching options as well as score filtering, gap penalties and masking also apply to clustering (see the Searching section for definitions): –alnout, –blast6out, –fastapairs, –matched, –notmatched, –maxaccept, –maxreject, –samout, –userout, –userfields |
序列去冗余
| 参数 | 描述 |
|---|---|
| –derep_fulllength | 序列去冗余 |
| –derep_prefix | 序列重命名 |
| –maxuniquesize N | 过滤高丰度reads |
| –minuniquesize N | 过滤低丰度reads，常用8，RPM1等 |
| –output filename | 输出结果 |
| –relabel string | 序列重命名，–sizeout保留丰度注释 |
| –relabel_keep | 重命名时保留原始名称 |
| –relabel_md5 | 按序列md5值重命名 |
| –relabel_sha1 | 按序列sha1值重命名 |
| –sizein | 考虑序列的丰度注释，search for the pattern ’[>;]size=integer[;]’ in sequence headers |
| –sizeout | 输出结果带丰度信息 |
| –strand plus或both | 默认只检测正链 |
| –topn N | 输出丰度前N个 |
| –uc filename | uclust结果格式 |
| –xsize | 去除丰度信息 |
| –eeout | –fastq_filter or –fastq_mergepairs, include the number of expected errors (ee) in the sequence header of FASTQ and FASTA files. This option is a synonym of the –fastq_eeout option. |
| –eetabbedout filename | –fastq_mergepairs命令输出统计结果 |
| –fastaout filename | 输出结果 |
| –fastaout_notmerged_fwd filename | 无法合并正向序列 |
| –fastaout_notmerged_rev filename | 无法合并反向序列 |
| –fastaout_discarded filename | 过滤抛弃的数据 |
| –fastq_allowmergestagger | 允许合并交错的序列(存在overhang) |
| –fastq_ascii N | 质量值类型，默认33，可选 64 |
| –fastq_asciiout N | 输出质量值类型 |
| –fastq_chars filename | 统计序列质量组成 |
| –fastq_convert filename | 33、64格式转换 |
| –fastq_eeout | 文件序列名中有期望错误率 |
| –fastq_eestats | 错误率统计报表 |
| –fastq_eestats2 | 错误率统计报表2 |
| –fastq_filter | 按质量或长度过滤fasta |
| –fastq_maxdiffs N | –fastq_mergepairs双端互补合并时最大错误率，默认为10，末端低质量且重叠区大时可增大此值 |
| –fastq_maxdiffpct real | 设置匹配比例，默认为100% |
| –fastq_maxee real | 最大错误率碱基个数阈值，–fastq_filter, –fastq_mergepairs or –fastx_filter,配合使用 |
| –fastq_maxee_rate real | 最大错误率碱基比例阈值，–fastq_filter, –fastq_mergepairs or –fastx_filter,配合使用 |
| –fastq_maxlen N | 最大长度 |
| –fastq_maxmergelen N | 合并后最大长度，默认无限制，可用于去除非目标片段序列 |
| –fastq_maxns N | 去除有N的序列 |
| –fastq_mergepairs filename | 双端序列合并，左端为默认参数，–reverse为右端文件, –fastqout指定输出文件 |
| –fastq_minlen N | 最小长度 |
| –fastq_minmergelen N | 合并后最小长度 |
| –fastq_minovlen N | 合并时最小重叠区 |
| –fastq_nostagger | 禁止合并末端不匹配overhang |
| –fastq_qmax N | 最大质量值，默认为41 |
| –fastq_qmaxout N | –fastq_convert转换时输出质量的最大值 |
| –fastq_qmin N | 最小质量值，默认为0 |
| –fastq_qminout N | 输出文件的最小质量值 |
| –fastq_stats filename | 序列长度、数量、质量统计 |
| –fastq_stripleft N | 左端切除碱基数，如barcode、正向引物 |
| –fastq_stripright N | 右端切除碱基数，如反向引物 |
| –fastq_tail N | 统计末尾4kmer频率，可修改长度 |
| –fastq_truncee real | 错误率过滤 |
| –fastq_trunclen N | 长度过滤 |
| –fastq_trunclen_keep N | 按长度过滤，但保留存序列 |
| –fastq_truncqual | 按质量值过滤 |
| –fastx_revcomp | 取反向互补 |
| –label_suffix string | –fastx_revcomp or –fastq_mergepairs结果重命名 |
| –maxsize N | 最高丰度阈值 |
| –minsize N | 最小丰度阈值 |
| –output filename | –fastq_eestats或–fastq_eestats2的质量统计结果 |
| –relabel_keep | 重命名时保留原始名称 |
| –relabel_md5 | 按序列md5值重命名 |
| –relabel_sha1 | 按序列sha1值重命名 |
| –reverse filename | 合并时指定右端 |
| –xsize | 移除丰度信息 |
屏蔽序列选项
Masking options:
扩增子中使用不多，此处P18-P19略，详见帮助
成对比对选项
Pairwise alignment options:
扩增子中使用不多，此处P19-P20略，详见帮助
搜索选项
Searching options: P20-27
搜索参数过多，有上百个，此处只列出常用的参数
| 参数 | 描述 |
|---|---|
| –alnout filename | 输出全局成对比较结果 |
| –biomout filename | biom1.0格式OTU表 |
| –blast6out filename | blast表格格式比对结果 |
| –db filename | 指定数据库或参考文件 |
| –gapext string | 设置gap扩展罚分 |
| –gapopen string | 设置gap打开罚分 |
| –id real | 相似度，常用0.97，0.99 |
| –samout filename | 比对结果为sam格式 |
| –search_exact filename | 完美匹配结果 |
| –usearch_global filename | 比对参考数据库、OTU |
洗牌参数
Shuffling options:
| 参数 | 描述 |
|---|---|
| **–randseed **N | 随机数种子，保证结果可重复 |
| –shuffle filename | 随机洗牌序列顺序 |
排序参数
| 参数 | 描述 |
|---|---|
| –maxsize N | 按–sortbysize排序时，丰度最大值 |
| –minsize N | 按–sortbysize排序时，丰度最小值 |
| –output filename | 输出文件 |
| –sizeout | 输出丰度 |
| –sortbylength filename | 按长度排序 |
| –sortbysize filename | 按丰度排序 |
| –topn N | 选择最长、最高丰度的 |
抽样参数 P29
Subsampling options:
| 参数 | 描述 |
|---|---|
| –fastaout filename | 输出fasta文件 |
| –fastaout_discarded filename | 剩余序列 |
| –fastqout filename | fq类型结果 |
| –fastqout_discarded filename | 剩余序列 |
| –fastx_subsample filename | 抽样fa/fq |
| –randseed N | 随机数种子 |
| –sample_pct real | 抽样比例0-100 |
| –sample_size N | 提取指定数量的序列 |
物种分类
Taxonomic classification options:P30
数据库为fasta文件，序列名格式 “>X80725_S000004313;tax=d:Bacteria,p:Proteobacteria,c:Gammaproteobacteria, o:Enterobacteriales,f:Enterobacteriaceae,g:Escherichia/Shigella,s:Escherichia_coli”.
| 参数 | 描述 |
|---|---|
| –db filename | 数据库 |
| –sintax_cutoff real | 最小的bootstrap支持率 |
| –sintax filename | 输入文件 |
| –tabbedout filename | 输出文件，4列表 |
索引格式UDB P31
UDB options:
| 参数 | 描述 |
|---|---|
| –dbmask none dust soft | 屏蔽序列方法，默认为none |
| –makeudb_usearch filename | 创建索引 |
| –output filename | 输出结果 |
| –udb2fasta filename | 数据库索引转fasta |
| –udbinfo filename | 检查索引信息 |
| –udbstats filename | 索引统计 |
| –wordlength N | 索引的词宽，3-15，默认8 |
刻意改变
DELIBERATE CHANGES —— P34
–cluster_size 命令将序列先排序，再聚类
–iddef 保留了可变成对比对一致比例的可调选项
–sizein 读取丰度 在去冗余和聚类中都可用，方便多批数据混合使用
对待U/T无区别
使用示例
数据库中序列两两比对
Align all sequences in a database with each other and output all pairwise alignments:
vsearch –allpairs_global database.fas –alnout results.aln –acceptall
De novo检测嵌合体，父母本的丰度至少为嵌合体的1.5倍
Check for the presence of chimeras (de novo); parents should be at least 1.5 times more abundant than
chimeras. Output non-chimeric sequences in fasta format (no wrapping):
vsearch –uchime_denovo queries.fas –abskew 1.5 –nonchimeras results.fas –fasta_width 0
97%聚类，并选择中心为代表序列，输出uclust格式
Cluster with a 97% similarity threshold, collect cluster centroids, and write cluster descriptions using a uclust-like format:
vsearch –cluster_fast queries.fas –id 0.97 –centroids centroids.fas –uc clusters.uc
序列去冗余，同时考虑序列名中的丰度信息，选择丰度大于1的序列
Dereplicate the sequences contained in queries.fas, take into account the abundance information already
present, write unwrapped fasta sequences to queries_unique.fas with the new abundance information, discard all sequences with an abundance of 1:
vsearch –derep_fulllength queries.fas –sizein –fasta_width 0 –sizeout –output
queries_unique.fas –minuniquesize 2
屏蔽序列中低复杂区域
Mask simple repeats and low complexity regions in the input fasta file with the DUST algorithm (masked
regions are lowercased), and write the results to the output file:
vsearch –maskfasta queries.fas –qmask dust –output queries_masked.fas
序列比对数据库，按80%相似度，考虑末端gap
Search queries in a reference database, with a 80%-similarity threshold, take terminal gaps into account when calculating pairwise similarities, output pairwise alignments:
vsearch –usearch_global queries.fas –db references.fas –id 0.8 –iddef 1 –alnout results.aln
自己比对自己，按60%相似度，输出blast6x结果
Search a sequence dataset against itself (ignore self hits), get all matches with at least 60% similarity, and collect results in a blast-like tab-separated format. Accept an unlimited number of hits (–maxaccepts 0), and compare each query to all other sequences, including unlikely candidates (–maxrejects 0):
vsearch –usearch_global queries.fas –db queries.fas –self –id 0.6 –blast6out results.blast6
–maxaccepts 0 –maxrejects 0
重排fasta文件
Shuffle the input fasta file (change the order of sequences) in a repeatable fashion (fixed seed), and write unwrapped fasta sequences to the output file:
vsearch –shuffle queries.fas –output queries_shuffled.fas –randseed 13 –fasta_width 0
按丰度排序
Sort by decreasing abundance the sequences contained in queries.fas (using the ’size=integer’ information),
relabel the sequences while preserving the abundance information (with –sizeout), keep only sequences
with an abundance equal to or greater than 2:
vsearch –sortbysize queries.fas –output queries_sorted.fas –relabel sampleA_ –sizeout –minsize 2
引文
Rognes T, Flouri T, Nichols B, Quince C, Mahé F. (2016) VSEARCH: a versatile open source tool for
metagenomics. PeerJ 4:e2584 doi: 10.7717/peerj.2584 https://doi.org/10.7717/peerj.2584
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