https://zhuanlan.zhihu.com/p/133676612qPCR引物设计，Primer3 Plus 和 Primerbank 都能搞定！ - 实验方法 - 丁香通
作者：苏点点
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下面是设计普通引物的原则：
- 引物长度大于16bp，18～24个核苷酸；
- 引物与靶序列间的Tm值不应该过低。两条引物之间尽量接近，差值不超过4℃；
- 引物不应该有发夹结构，不能有4bp以上回文序列；
- 两引物间不应有大于4bp以上的互补序列或同源序列，在3’端不应有任何互补碱基；
- 碱基尽可能均匀分布，GC含量在40～60%；
- 引物尽量不形成二级结构。
那qPCR还有什么要求呢？
qPCR除了上述的设计原则之外，还需要多考虑一两个方面，一个就是引物能扩增的目的条带bp数，尽量在200bp以下，当然你选500bp也行，但是效果可能没有那么好。因为qPCR不需要扩增一个基因的全长，只要证明能扩增出与目的基因特异的片段就可以了。所以，qPCR的反应一般采用两步法，因为扩增的片段非常短，速度非常快；只有在两步法不理想的情况下才会选择三步法，但是无论怎样，qPCR反应设置的时间总会比普通PCR会短一些，也没有最后的总扩增过程。
第二点就是考虑引物的特异性和是否自身形成引物二聚体，如果特异性不高，就容易扩增出非目的基因的片段，使qPCR出现杂峰；而形成引物二聚体也会出现杂峰。
总之，先用Primer Premier 6设计引物，根据设计的结果筛选出最好的引物；然后去NCBI上反向对引物进行blast，看看是否在特定物种中是特异的；最后要结合实际的qPCR结果分析，由现象反推原因，有问题就要调整好重新实验
在设计qPCR引物时，通常要留意以下几点：
GC含量50%-60%、Tm值50℃-65℃且上下游引物尽量接近、引物末端最好是G或C、引物尽量在目的基因的3’ 端、引物尽量跨越内含子、目的基因是否有不同的剪切变体……
下面，我们以人的EGFR（Epidermal growth factor receptor，表皮生长受体因子）基因为例，设计一对可以同时扩增其不同剪切变体的qPCR引物！
01
查询基因结果
首先，通过NCBI查询Homo EGFR的基因结构，这里要注意对比基因名称、种属，确保都要一致。
02
确定引物位置
我们的目的是将不同的转录本都扩增出来，所以需要找到这些转录本的同源序列。可以看到，这个基因有多个不同的转录本，第一个转录本的第8、9个外显子区域是所有转录本的同源序列（红框内的绿色小竖线）。只需要将引物设在第8、9个外显子之间就可以了。
03
找到mRNA的序列号 进入GenBank
