メチル化 RNA 免疫沈降 (MeRIP-seq/m6A-seq) 実験の方法を、技術原理、ライブラリー構築とシーケンスのプロセス、情報解析のプロセス、研究ルーチンの 4 つの側面から詳しく紹介します。
1. メチル化RNA免疫共沈降法（MeRIP-seq/m6A-seq）シーケンス技術の原理
エピトランスクリプトームとは、RNA の化学修飾が RNA 配列を変えることなく遺伝子発現を制御する現象を指します。細胞内 RNA には 100 種類以上の修飾があり、エピジェネティックな修飾のほとんどは tRNA などの非コーディング RNA に対して発生します [1]。mRNA に対する修飾は種類、量ともに比較的少ないです。以下の図は、真核生物の mRNA に生じる化学修飾の一部を示しています[2]。
図 1: mRNA メチル化修飾の模式図
mRNA 上の最も多くの修飾は、アデニル酸の N6 位のメチル化修飾 (N6-メチルアデノシン、m6A) であり、m6A は mRNA のライフサイクルのあらゆる側面に関与しています [2]。 m6A 修飾は主に RRACH (R = G または A および H = A、C、または U) などのモチーフで発生します。このタイプのモチーフは主に終止コドンと 3'UTR で濃縮されます。つまり、m6A は主にコドンで発生します。停止コドン.サブおよび 3'UTR 付近。 m6A 修飾は、m6A メチルトランスフェラーゼ (ライター) によって触媒され、m6A デメチラーゼ (イレーザー) によって除去され、m6A 結合タンパク質 (リーダー) によって認識されて機能します [3]。 m6A 修飾は、ウイルス、酵母などの高等動物、植物、人間を含むさまざまな生物に広く見られます [1、3]。
研究によると、m6A の最も重要な既知の機能は、mRNA の安定性を調節することです。細胞質内の m6A 修飾 mRNA は YTHDF2 によって認識され、プロセシングが強化されます。ボディ（P-ボディ）に影響を与え、mRNA の分解を促進します。 さらに、m6A 修飾は RNA の二次構造を変化させ、マイクロ RNA の標的認識を調節して mRNA の安定性を調節することもできます。核では、m6A 修飾により RNA スプライシングと核外輸送プロセスが制御され、それによって遺伝子発現が制御されます。 m6A は DNA メチル化とも相互作用する可能性があります。以下の図は、現在知られているいくつかの m6A と生物学的機能の関係を示しています。
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図 2: m6A と生物学的機能
初期の実験方法により、rRNA および mRNA における m6A の存在が確認されましたが、実験技術の限界により、m6A の研究には大きな進歩はありませんでした。近年、RNAデメチラーゼFTOの報告により、m6A修飾の研究が再び人々の視野に入るようになりました。その後、MeRIP-seq/m6A-seq 実験手法が確立されたことで、この修飾の分布と機能について詳細な研究を行う機会が得られました [1]。
MeRIP-seq/m6A-seq テクノロジーを使用して、ゲノム全体で m6A 修飾のある領域を特定しました。原理は、m6A 修飾を特異的に認識する抗体を介して細胞内で m6A 修飾を含む RNA 断片を免疫共沈降させることです。沈殿した RNA 断片に対してハイスループットシーケンスを実行し、それをバイオインフォマティクス解析と組み合わせることで、m6A 修飾の状態をゲノム全体にわたって系統的に研究できます。 MeRIP-seq/m6A-seq は、現在、m6A 修飾を研究するために最も広く使用されている技術の 1 つです。
2. メチル化 RNA 免疫共沈降 (MeRIP-seq/m6A-seq) 実験プロセス
サンプル処理から最終データ取得までのすべてのステップはデータの質と量に影響を与え、データの質はその後の情報分析の結果に直接影響します。ソースからのシーケンスデータの精度と信頼性を確保するには、サンプル処理、ライブラリ構築、シーケンスの各ステップを厳密に制御して、基本的に高品質のデータの出力を保証する必要があります。フローチャートは次のとおりです。
(1) Total RNA サンプルの検出
RNA サンプルの検出には主に 3 つの方法があります。
(1) アガロースゲル電気泳動により、RNA の分解の程度と汚染の有無が分析され、明らかな 18S または 28S のメインバンドが検出され、バンドは鮮明です。
(2) Qubit 2.0 は RNA 濃度を正確に定量し、検出される total RNA の総量は 10ug 以上です。
(3) Agilent 2100 は RNA の完全性を正確に検出し、RIN 値は 7.5 以上です。
(2) 図書館建設
1. RNA の断片化:
10ug の total RNA を取り、RNA Fragmentation Reagents (Invitrogen) を加え、Thermomixer 内で 70°C で 10 分間反応させ、RNA を断片サイズ約 100 nt の断片に分割します。エタノールを使用して断片化 RNA を沈殿させます。
2. m6A エンリッチメント:
プロテイン A およびプロテイン G を含む磁気ビーズを IP バッファー (150 mM NaCl、10 mM Tris-HCl pH 7.5) で洗浄し、その後 5 μg m6A 抗体 (Millipore) とともに 4℃ で 2 時間インキュベートし、 IP バッファーで磁性ビーズを再懸濁し、断片化 RNA を加え、4℃で 4 時間転倒混和します。磁性ビーズを 4℃の IP バッファーで 3 回洗浄し、m6A 競合溶出液を使用して 30℃ でインキュベートします。 4℃で1時間。溶出した m6A RNA を含む上清を新しい試験管に集め、フェノール:クロロホルム:イソアミル アルコール (125:24:1) で精製します。
3. ライブラリの構築:
説明に従って SMARTer® Stranded Total RNA-seq Kit v2 - Pico Input Mammalian User Manual を使用し、IP および入力サンプルの逆転写とライブラリ構築を実行します。AMPure XP を使用します。最終ライブラリを取得するために、フラグメント サイズの選択が実行されました。
構築図は次のとおりです: m6a 抗体を使用して m6a をプルダウンします。
図 3: 濃縮プロセスの概略図
(3) ライブラリの品質検査
ライブラリの構築が完了したら、最初に Qubit2.0 を使用して予備定量を行い、ライブラリを 1ng/ul に希釈し、次に Agilent 2100 を使用してライブラリのインサート サイズを検出します。インサート サイズが期待どおりになったら、qPCR メソッドを使用してライブラリの有効濃度を正確に定量し（ライブラリ有効濃度 > 2nM）、ライブラリの品質を確保します。
(4) オンマシンシーケンス
ライブラリがテストに合格すると、有効濃度とターゲットのオフマシン データ量の要件に従ってさまざまなライブラリがプールされ、Illumina Nova プラットフォームでシーケンスされます。
3. メチル化RNA免疫共沈降（MeRIP-seq/m6A-seq）情報解析プロセス
(1) オリジナルオフラインデータの品質管理
元のオフライン データは、高スループット シーケンスの標準形式である FASTQ 形式です。 FASTQ ファイル内の 4 行ごとが 1 単位であり、シーケンス シーケンス (読み取り) に関する情報が含まれます。ユニットの最初の行はリードの ID で、通常は @ 記号で始まります。2 行目はシーケンスシーケンス、つまりリードのシーケンスです。3 行目は通常 + 記号、または同じ情報です。 1 行目; 4 行目は、塩基品質値は、配列の 2 行目の塩基の精度を示します。1 つの塩基が塩基品質値に対応するため、この行と 2 行目の長さは同じです。以下は既読メッセージの例です。
図 4: FASTQ フォーマットの例
元のオフライン データには、ライブラリ構築中に導入されたアダプター シーケンスと低品質の塩基が含まれています。これらの要因により、その後ゲノムと比較されるリードが減り、情報が少なくなります。そのため、フィルタリングが必要です。
Trimmomatic ソフトウェアを使用して、元のデータに対して品質管理手順を実行し、アダプター シーケンスと低品質の塩基を削除します。使用されるパラメータは次のとおりです: ILLUMINACLIP:MeRIP-PE.fa:2:30:10: 1:true SLIDINGWINDOW:30:15 AVGQUAL:15 LEADING:15 TRAILING:15 MINLEN:30
(2) データ比較
フィルタリングされたデータは参照ゲノムと比較する必要があります。 ゲノム上の m6A 修飾セグメントには比較するリードが多数あるため、「ピーク」が形成されます。 "。ピークの位置に基づいて、ゲノム内のどの位置がメチル化されているかを判断できます。
アライメントには hisat2[4] が使用されます。このソフトウェアは、短い配列を参照ゲノムに迅速にアライメントでき、特に RNA データのアライメントに適したスプライシング サイトを考慮して処理できます。使用されるパラメータはデフォルトのパラメータです。比較が完了した後、結果パスはフィルタリングされ、複数の比較が削除され、低品質の比較が削除され、より正確な比較結果が得られます。
(3) m6A修飾領域の検出
MeRIP-seq は、RNA 上の m6A 修飾領域を濃縮してからシーケンシングを実行します。 したがって、m6A 修飾領域の IP ライブラリでカバーされるリード数は大幅に増加します。入力ライブラリよりも大きくなり、それによって「ピーク」が形成されます。これらのピークの位置を検出することで、m6A 修飾が発生する RNA 上の位置を特定できます。
m6A 修飾が特定された後、アノテーション、分布統計、モチーフの特定などの m6A 修飾を分析します。 m6A 生体情報解析内容
(4) 異なる m6A 修飾領域の同定
異なる m6A 修飾 (つまり、異なるピーク) の同定には、R パッケージ exomePeak [5,6] を使用します。この R パッケージは、まず比較する必要があるサンプルのピークをマージし、次に各サンプルのマージされたピークの累積リード数を計算し、次にこれらのリードを標準化して 2 つのサンプル グループを同等のレベルにし、最後にテストします。 2 つのグループ このピーク内のサンプル間に読み取り数に有意な差があるかどうか。使用されるパラメータは次のとおりです: WINDOW_WIDTH=200 SLIDING_STEP=30 DIFF_PEAK_ABS_FOLD_CHANGE = 1.5 FOLD_ENRICHMENT=1.5 FRAGMENT_LENGTH=200。
異なる m6A 修飾を特定した後、アノテーション、分布統計、モチーフの同定など、異なる m6A 修飾を分析できます。
(5) mRNA遺伝子発現量の解析入力はバックグラウンドコントロールと同等
m6A-seq の入力ライブラリは RNA-seq ライブラリと同等であり、遺伝子発現を分析し、差次的に発現する遺伝子を同定するために使用できます。遺伝子発現レベルは、ゲノム領域または遺伝子エクソン領域にマッピングされるシーケンス配列 (リード) をカウントすることによって推定されます。リード数は、遺伝子の真の発現レベルに直接比例することに加えて、遺伝子の長さと配列の深さとも正の相関があります。異なる遺伝子間および異なる実験間で計算された遺伝子発現レベルを比較できるようにするために、TPM を使用してリード数を標準化します。このアルゴリズムは、シーケンスの深さと遺伝子の長さがカウントに与える影響を考慮しています。現在最も一般的な方法です。遺伝子発現レベルを計算するため。
図 5: TPM 計算式
注: Ri は遺伝子の読み取りカウント数を表し、Li は遺伝子の長さ (kbp) を表し、最も長い転写産物が選択されます。遺伝子の長さとして。発現計算ソフトウェアは StringTie [7] で、デフォルトのパラメーターを使用し、遺伝子発現の表示には TPM が使用されます。
(6) lncRNAのスクリーニング、同定および発現計算
トランスクリプトを組み立てることにより、アノテーション ファイルの外にある新しいトランスクリプトを発見できます。これらの新しい転写物は一連の厳しい条件下でスクリーニングされ、非コード RNA が同定されました。
(1) ソフトウェア StringTie[7] を使用してトランスクリプトを組み立て、各サンプルのすべてのトランスクリプトを取得し、注釈ファイルに表示されないトランスクリプトを新しいトランスクリプトとしてマークします。新しい転写産物のフィルタリング条件は次のとおりです。 a) 各サンプルのアセンブリ アノテーション ファイルについて、エクソン番号 >=2 であるが FPKM <=0.5 の転写産物、またはエクソン番号 >=1 であるが FPKM <=1 の転写産物を除外します。これ[8] ; b) 単一転写物のスプライシング結果で 200 bp 未満の長さの転写物をフィルタリング; c) StringTie[7] を使用して、上記の単一フィルタリングされたアセンブルされた転写物を最終的にアセンブルされた転写物にマージ; d) Cuffcompare[9] を使用します。未知の転写物と既知の転写物との間の関係。
(2) 候補 lncRNA コード能力の予測。 lncRNAはノンコーディングRNAの一種であり、候補lncRNAのコーディング能力を予測することで、さらに真のlncRNAを同定することができます。さまざまな主流のコーディング能力予測ソフトウェアを使用して、候補 lncRNA のコーディング能力を予測します。予測ソフトウェアには、CNCI [10] および CPC [11] が含まれます。
(3) ゲノム上のアノテーション付き lncRNA 遺伝子情報に基づいて既知 lncRNA の発現を計算します。
(4) 式の計算。 lncRNA の発現は TPM で正規化されました。
(7) circRNAの同定と発現計算
2 つの主流ソフトウェアを使用して circRNA [12] を特定し、最終的に 2 つのソフトウェアの結合を最終予測結果として取得します。 2 つのソフトウェアは、find_circ[13] と CIRCexplorer2[14] です。
(1) Find_circ の予測原理を次の図に示します。
図 6: find_circ ソフトウェアの識別原理
基本原理は、参照配列にアラインメントされていないリードの両端から 20 nt のアンカー配列を抽出し、アンカー配列の各ペアを参照配列に再度アラインメントすることです。は参照配列に整列され (開始部位と停止部位はそれぞれ A3 と A4 としてマークされます)、アンカー配列の 3' 末端はこの部位の上流に整列されます (開始部位と停止部位は A1 と A4 としてマークされます)。参照配列の A2 と A3 の間にスプライシング部位 (GT-AG) がある場合、このリードは候補 circRNA とみなされます。最後に、リード数が 2 以上の候補 circRNA は、同定された circRNA とみなされます。比較に使用したソフトウェアは bowtie2 [15] です。
(2) CIRCexplorer2 の測定原理を下図に示します。
図 7: CIRCexplorer2 ソフトウェア識別原理
このソフトウェアは、TopHat2/TopHat-Fusion、STAR、MapSplice、BWA、segemehl などのさまざまな RNA アライナーをサポートしています。比較には STAR [16] ソフトウェアを使用しました。
発現計算：circRNAアンカー配列のリードカウント値を計算するため、正規化時のcircRNAの発現計算にはSRPBM[17]を使用する。式は次のとおりです。
図 8: SRPBM 発現計算式
注: Ri は circRNA アンカー配列のリード数を表し、Li は circRNA アンカー配列の長さ (kbp) を表します。
(8) 差次的に発現する遺伝子の同定
各サンプルの遺伝子発現レベルを取得した後、対照グループと比較して治療グループでどの遺伝子発現レベルが大幅に変化したかを判断するために、サンプル間の差異各グループでは遺伝子解析が行われました。各サンプルグループの遺伝子の読み取り数に応じて、最も広く使用されている差分遺伝子解析ソフトウェアを使用して、差分遺伝子解析を実行できます。生物学的重複解析用ソフトウェアは DESeq2 [18]、非生物学的重複解析ソフトウェアは DESeq2 [18] です。重複分析はエッジャーです。
(9) 差次的発現遺伝子濃縮解析
Clusterprofiler を使用して、GO および KEGG 濃縮分析と、差次的に発現した mRNA、差次的に発現した cicrRNA のソース遺伝子、および差次的に発現した lncRNA のターゲット遺伝子のマッピングを実行しました。
(10) 差次的m6A関連遺伝子と差次的発現遺伝子のオーバーラップ解析
示差的な m6A 関連遺伝子と示差的に発現される遺伝子の間の重複関係を理解するために、次の統計を実行しました。3) 四象限図を使用して表示します。 ( (2) (1)で取得した遺伝子と発現差のある遺伝子との重複関係を特定します。 ; 対応する差分ピークがない可能性があり、その場合、遺伝子は表示されません。 各遺伝子に関連付けられた差分ピークを取得します (有意なピークと有意でないものを含む)。1 つの遺伝子が複数のピークに対応する場合があります。この場合、この遺伝子は複数のピーク. 回 (1)
(11) 情報分析プロセスの概念図
図 9: 分析プロセスの概念図
4. まとめ: メチル化 RNA 共免疫沈降 (MeRIP-seq/m6A-seq) 研究アイデア
MeRIP は、m6A 特異的抗体の濃縮と配列決定を通じて RNA のアデノシンメチル化修飾を研究するために使用されます。 YiGene はマイクロ RNA メチル化検出技術を独自に開発しており、サンプルの開始量を 10 ～ 20 μg に減らすことができ、最低でも合計 RNA は 5 μg です。
m6A研究のアイデア
- m6A メチル化マップ全体の特徴を理解する: m6A ピーク数の変化、m6A 修飾遺伝子数の変化、単一遺伝子内の m6A ピーク数の解析、遺伝子要素上の m6A ピークの分布、モチーフm6Aピークの解析、およびm6Aピーク修飾遺伝子の機能解析。
- 特異的な示差的 m6A ピークおよび遺伝子のスクリーニング: 示差的 m6A ピークの同定、非連続データの分析戦略、連続データの分析戦略、示差的 m6A 修飾遺伝子の機能分析、示差的 m6A 修飾遺伝子の PPI 分析、および m6A 修飾の視覚的表示候補遺伝子の
- m6A メチロームおよびトランスクリプトーム関連解析: メタ遺伝子全体の関連、DMG-DEG 対応関連、m6A 修飾標的遺伝子のスクリーニング戦略。
- さらなる検証または後期段階の試験。
5. メチル化RNA免疫共沈降（MeRIP-seq/m6A-seq）研究プロジェクト事例
タイトル: セボフルランは m6A 媒介 mRNA 翻訳を障害し、微細運動障害および認知障害を引き起こす セボフルラン麻酔は m6A 媒介 mRNA 翻訳を障害し、微細運動障害および認知障害を引き起こす
時期：2021年
期刊：細胞生物学と毒性学
インパクトファクター: IF 6.691
技術プラットフォーム: m6A-seq (MeRIP-seq)、RIP-seq (RNA 結合タンパク質免疫沈降)、scRNA-seq
研究概要:
この研究では、全身麻酔薬による乳児や幼児の微細運動能力への損傷のメカニズムを調査し、セボフルラン麻酔の微細運動能力への影響におけるm6Aメチル化の役割とメカニズムに初めて焦点を当てています。
これまでの研究では、全身麻酔薬によって引き起こされる神経発達毒性のメカニズムは、ヒト以外の霊長類と齧歯動物モデルでは依然として異なることが判明しており、例えば、複数回の全身麻酔と手術が乳児に長期にわたる言語障害を引き起こす可能性があることが臨床的に観察されているまた、麻酔後の社会的能力の低下やさまざまな社会的行動の障害は、ヒト以外の霊長類モデルでは観察されているが、複数回麻酔をかけられた若いラットでは社会的能力の障害を観察することは困難である。研究者らは、全身麻酔薬によって引き起こされる認知障害の非ヒト霊長類および齧歯動物モデルでは、同じ方向に変化する遺伝子が存在するはずであり、逆方向に変化する遺伝子も存在するはずであると考えています。臨床現場で全身麻酔薬の原因となる遺伝子を解析し、神経発達毒性の重要な科学的問題を解明し、次に非ヒト霊長類マカクを用いて全身麻酔薬による神経発達毒性のメカニズムの手がかりを探索し、同じ変化を持つ標的遺伝子を見つけます。マカクザルとマウスを使用し、マウスモデルを使用して検証します。
この概念に基づいて、研究者らは、全身麻酔と術後の長期微細運動障害との間のメカニズムを研究するために、ヒト以外の霊長類およびげっ歯類を使用することに焦点を当ててきた。 m6A 修飾は RNA メチル化修飾の中で最も多く存在する修飾であり、YTHDF1 は m6A メチル化の認識タンパク質の 1 つです。最近の研究では、神経認知の形成と発達に関与している可能性があることが判明しました。その後のメカニズム研究では、セボフルラン麻酔後の幼若霊長類およびげっ歯類の脳において、m6A 結合タンパク質 YTHDF1 の発現が大幅に下方制御されることが判明しました。単一細胞トランスクリプトーム配列決定 (scRNA-seq) により、sp8 陽性ニューロンにおける YTHDF1 発現の減少は介在ニューロンで最も顕著であり、これらのニューロンはその後 VIP 介在ニューロンに発達することがわかりました。 YTHDF1 の主な機能は、RNA 上のメチル化部位を認識することです。 RIP実験（RNA結合タンパク質免疫沈降）とm6A-seq配列解析により、m6AがシナプトフィジンのmRNA上に高度に濃縮されており、シナプトフィジンのmRNA上にYTHDF1の結合部位が存在することが判明した。これまでの研究では、シナプトフィジンが全身麻酔薬の神経発達毒性と密接に関連していることがわかっています。 YTHDF1 の過剰発現は、若いマウスのセボフルラン誘発性の細かい運動能力と認知機能障害、さらにはシナプトフィジンの変化を救済する可能性があります。研究によれば、YTHDF1 は下流の標的遺伝子であるシナプトフィジンの発現を m6A メチル化依存的に調節し、それによってマウスの細かい運動能力と認知機能に損傷を与えることが示唆されています。この研究は、全身麻酔薬が乳児や幼児の細かい運動能力に損傷を与えるメカニズムを調査しており、全身麻酔薬の神経発達毒性を予防または治療するための新しいアイデアを提供することが期待されます。
図 1: 研究概要
図 2: scRNA-seq により、セボフルランが介在ニューロンにおける YTHDF1 発現を低下させることが明らかに
図 3: MeRIP-seq は、YTHDF1 が m6A 依存的にシナプトフィジンを調節することを明らかにします
上記は、メチル化 RNA 共免疫沈降 (MeRIP-seq/m6A-seq) の実験手順と解析アイデアの紹介です。Yigene Technology は、RNA メチル化研究のための包括的な総合ソリューションを提供します。技術的な詳細については、Yigene 0755 -28317900 までお問い合わせください。 。
参考文献: