[中国科学院] 分子生物学 - 朱玉賢 第 4 版 - ノート - ウイルスの分子生物学

ウイルスの分子生物学

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12. ウイルスの分子生物学（教科書第9章）

12.1 ウイルスの基本概念

●感染症に関する概念

• 病原体: 人体に病気を引き起こす微生物。
• 細菌とウイルスは最もよく知られた病原体です
• 真菌、原生動物、寄生虫も病気の原因となります：体部白癬、マラリア、血管強虫症、カントニア症など。
• 感染症: 人から人へ広がる可能性のある病原体

●一般的な微生物病原体

ウイルスの概念と特徴

• ウイルスは、細胞構造を持たず、宿主細胞によって継承および複製される核酸とタンパク質で構成される微生物の一種です。
• 特徴：
  （1）電子顕微鏡でしか観察できないナノスケールの
  粒子、 （2）細胞構造がなく、主成分は核酸とタンパク質のみ、
  （3）各ウイルスにはDNAまたはRNAのいずれか1つの核酸のみが含まれる。ゲノムサイズ: 3kb - 1.2Mb
  (4) ウイルスは独立して複製できず、宿主の生細胞内の既存の代謝系を使用することによってのみ独自の核酸およびタンパク質成分を
  合成できます;
  (6) インビトロ条件下では、ウイルスは非生きた生体高分子の状態で存在し、感染力を長期間維持する (7
  ) 一般的な抗生物質には感受性がないが、インターフェロンには感受性がある (8 )
  一部のウイルス 核酸は宿主のゲノムに組み込まれることもある潜在的な感染を誘発します。
  

ウイルスの分類と形態

●ウイルスの分類

• 遺伝物質による分類：DNAウイルス、RNAウイルス、タンパク質ウイルス（例：プリオン）
• ウイルスの構造による分類：真のウイルス（ユーウイルス、略してウイルス）とサブウイルス（ウイロイド、シュードウイルス、プリオンを含むサブウイルス）
• 宿主の種類による分類：バクテリオファージ（細菌ウイルス）、植物ウイルス（タバコモザイクウイルスなど）、動物ウイルス（鳥インフルエンザウイルス、天然痘ウイルス、HIVなど）
• 性質により、軽度のウイルス（HIV）、重度のウイルス（狂犬病ウイルス）に分けられます。

ウイルスの形態
(1) スフェロウイルス; (2) バキュロウイルス; (3) ブリックウイルス; (4) コロナウイルス; (5) フィロウイルス; (6) ストレプトウイルス; (7) エンベロープウイルス (8) 球形の頭部を持つウイルス; (9) 昆虫
ウイルス封入体に囲まれています。

ウイルスの構造

(1) ウイルスの基本構造

• ウイルス粒子( virus particle): 具体的には、主に内部遺伝物質とタンパク質シェルで構成される、成熟し、構造的に完全で、感染性のある単一のウイルスを指します。
• その中心にはコア( ) またはゲノムと呼ばれる核酸がありcore、タンパク質がコアを取り囲んでカプシド( capsid) を形成します。コアとキャプシドを総称してコアシェル（nucleocapsid）と呼びます。
• カプシドの機能：①抗原性、②核酸の保護、③ウイルスと宿主細胞の結合の仲介。

(2) ウイルスの補助構造

• 一部のより複雑なウイルス (通常はインフルエンザ ウイルスなどの動物ウイルス) は、ウイルスのヌクレオカプシドの外側にリポタンパク質二重層膜構造を持っています。これは、ウイルスが出芽によって放出され、エンベロープと呼ばれる宿主細胞膜または核膜を通過するときに得られます。エンベロープの表面には、ウイルスがコードする糖タンパク質がスパイクと呼ばれるスパイク状の突起にはめ込まれています。エンベロープを持ったウイルスは有機溶媒に敏感です。
• エンベロープの機能: ① ヌクレオカプシドの保護: ② ウイルスや宿主細胞の吸着促進: ③ 抗原性。

●一般的に対称: ウイルス粒子の対称系は 2 つだけです。すなわち、らせん対称(タバコ モザイク ウイルスを表す) と正二十面体対称(等軸対称、アデノウイルスを表す) です。より複雑な構造を持つ一部のウイルスは、本質的に上記 2 つの対称性の組み合わせの結果であるため、それらは複合対称性(T の偶数番号のファージを表す)と呼ばれます。

12.2 一般的なウイルスと関連疾患

一般的なウイルスと関連疾患の紹介

• 天花天然痘ウイルスによって引き起こされる重篤な感染症で、回復後に顔にあばたが残ることから「天然痘」と呼ばれるようになりました。天然痘ウイルスは急速に増殖し、驚くべき速度で空気中に広がります。患者の傷跡が剥がれるまで、天然痘は患者から他の人に感染する可能性があります。かつて一部の歴史家は、人類史上最大の大量虐殺は銃によってではなく天然痘によって達成されたと述べた。ワクシニアワクチンの応用と普及により、天然痘は人類で初めて完全に根絶された感染症となり、これは感染症との闘いにおける人類の最高の成果と言えます。

• 流行性感冒(略してインフルエンザ) は、主に空気中の飛沫、人との接触、または汚染された物品との接触を介して、インフルエンザ ウイルスによって引き起こされる、伝染性が高く急速に広がる急性呼吸器感染症です。
  典型的な臨床症状としては、主に、突然の高熱、全身痛、著しい倦怠感、軽度の呼吸器症状などがあります。一般に、秋と冬が発生率の高い時期であり、それによる合併症や死亡は非常に深刻です。
  インフルエンザウイルスは、その表面構造（スパイク）にちなんで命名されました。たとえば、 H5N1の場合、Hはヘマグルチニンを表し、その機能はウイルスが宿主細胞に結合できるようにすること、Nはノイラミニダーゼを表し、その機能は自己複製したウイルスを細胞から放出することです。インフルエンザAでは、Hは16のサブタイプに分類でき、Nは9つのサブタイプに分類できます。これらのサブタイプはすべて鳥から分離されています。

• 埃博拉病毒1976年にスーダン南部とコンゴのエボラ川地域で最初に発見されたこのウイルスは、人間や他の霊長類にエボラ出血熱を引き起こす可能性がある重篤な感染症ウイルスであり、これによって引き起こされるエボラ出血熱は、世界で最も致死率の高いウイルス性出血熱です。今日の世界では、死亡率が50%から90%の間で、2014年から2016年の間にアフリカで11,000人が死亡しました。現在、エボラ出血熱ワクチンの使用が承認され、エボラ出血熱克服への希望がもたらされています。

• 艾滋病毒ヒト免疫不全ウイルス ( HIV ) としても知られ、1981 年 6 月 5 日に米国疾病管理予防センターによって最初に報告されました。主に人体の T リンパ球を攻撃し、免疫系の機能不全を引き起こし、患者は他の一般的な病原体の感染症や悪性腫瘍によって死亡することがよくあります。「カクテル療法」がエイズの進行を効果的に制御できることは一般に認識されているが、これまでのところ、エイズは依然として最も困難な医学的問題の１つである。

• 冠状病毒体系的な分類ではネストウイルス科-コロナウイルス科-コロナウイルス科に属し、自然界に広く存在するRNAウイルスの大きな分類である。2019 年の新型コロナウイルス (2019-nCoV) は、人に感染する可能性がある既知の 7 番目のコロナウイルスであり、他の 6 つは HCoV-229E、HCoV-OC43、HCoV-NL63、HCoV-HKU1、および SARS-CoV 重症急性呼吸器症候群です) MERS-CoV（中東呼吸器症候群を引き起こす）。

レトロウイルス

●レトロウイルスの発見

• RSV (ルーの石棺ウイルス) は、1910 年にペイトン ラウスによって発見されました。ペイトン・ロウズは鶏の腫瘍から物質を抽出し、健康なプリマスロック鶏に注射したところ、腫瘍抽出物が腫瘍形成を誘発する可能性があることを発見した。
• ペイトン・ラウスは1966年のノーベル生理学・医学賞を受賞した。
  

レトロウイルスのゲノム

• レトロウイルスは癌遺伝子 src (ウイルスは元々srcを持たず、宿主に感染した後にsrcを取得します。）。
  

がんに関する 3 つの概念

• 癌基因 (oncogene)欠陥のあるシグナル伝達タンパク質をコードします。細胞に分裂の信号を与え続けることで、腫瘍が形成されます。癌遺伝子は遺伝的に優性である_、欠陥のある成長因子、受容体、G タンパク質、プロテインキナーゼ、または核転写調節因子をコードしている可能性があります。
  ◆がん遺伝子によってコードされるタンパク質：
  

• 抑癌基因 (Tumor suppressor gene)細胞分裂の阻害、DNA エラーの修復、またはアポトーシスの制御を行う制御タンパク質をコードします。腫瘍抑制遺伝子が適切に機能しない場合、細胞が制御不能に増殖し、がんが発生する可能性があります。これらの遺伝子の変異により、遺伝的に劣性ですが、腫瘍形成を引き起こす可能性があります。
  ◆一般的な腫瘍抑制遺伝子:
  

• 原癌基因（细胞转化基因） Proto-oncogene ; Cellular oncogene, C-onc
  細胞ゲノム内に存在し、通常は静的または低レベル（制限的）発現状態で存在し、細胞の正常な機能を維持するために重要な役割を果たしていますが、発がん性因子によって活性化されると悪性腫瘍を引き起こします。細胞の変容。

●対応する癌原遺伝子からの癌遺伝子の生成:

• 点突然変異
• 染色体転座。2 つの遺伝子が融合して、親タンパク質の活性とは異なるキメラタンパク質をコードするハイブリッド遺伝子が生成されます。
• 増殖調節遺伝子を別のプロモーターの制御下に置き、その遺伝子の異常な発現を引き起こす染色体転座
• がん原遺伝子を含むDNA セグメントの異常な増幅と複製により、コードされたタンパク質が過剰生産される

癌原遺伝子のウイルス癌遺伝子への形質転換

1. レトロウイルスのスパイクが宿主細胞膜表面の受容体に結合し、エンドサイトーシスが起こり、ウイルスのRNAが宿主細胞に侵入します。
2. レトロウイルス RNA ゲノムは二本鎖 DNA に逆転写され、癌原遺伝子の隣の宿主細胞に組み込まれます。
3. 癌原遺伝子がウイルスゲノムに組み込まれた後、パッケージングされて新しいウイルスが形成され、宿主細胞内で大量に増幅された後にウイルスが放出されます。
4. 新しいウイルスは他の宿主細胞に感染を続け、感染過程で癌原遺伝子が宿主細胞の悪性化を引き起こす癌遺伝子に変異する可能性があり、変異しなくても癌原遺伝子の発現が異常に増加する。
   

12.2.1 HIV HIV 2× (+)ssRNA

HIV

• HIV はヒト免疫不全ウイルスです。後天性免疫不全症候群、つまりエイズの原因となるのはこのウイルスです。
• HIV は主に、ヘルパー T 細胞 (特にCD4+ T 細胞)、マクロファージ、樹状細胞など、ヒトの免疫系の重要な細胞に感染します。
• エイズは、人の免疫システムが非常に損傷し、病気や特定のがんと戦うことが困難になる、HIV 感染の進行段階です。
• 現在、HIV 感染症の治療法はありません。
• HIV はレトロウイルスであり、その RNA ゲノムは二本鎖 DNA に逆転写され、宿主細胞の DNA に組み込まれます。
• HIV コア粒子にはRNA ゲノムの2 つのコピーが含まれており、それぞれがプライマー (宿主 tRNA) と逆転写酵素 (RT) に結合しています。コア粒子は、スパイクタンパク質を含むエンベロープによって囲まれています。
• アクセサリータンパク質はビリオンの形成と潜伏を調節します。
• 古代のレトロウイルス配列は、ヒトゲノムを含む動物のゲノムに存在します。

HIV ゲノムと構造

• HIV は2 つのコピーで構成されます(正链直接翻訳できる) 一本鎖 RNA で構成され、ウイルスの9 つの遺伝子(ただし、発現タンパク質は9種類以上あり、例えばgag遺伝子で発現するタンパク質はp17、p24、p7に切断されます。)、ウイルスタンパク質の2,000 コピーp24からなる円錐形のキャプシドCaspidに囲まれています。
• 一本鎖 RNA は、逆転写酵素、プロテアーゼ、リボヌクレアーゼ、インテグラーゼなどの に強く結合し核衣壳蛋白、p7ビリオンの発生に必要です。酶
• ウイルスタンパク質p17で構成されるマトリックスがキャプシドを取り囲み、ビリオン粒子の完全性を保証します。
• ウイルスエンベロープ:ヒト細胞から採取された脂肪分子 (リン脂質) の 2 層。
• Env三量体キャップ(3 つの糖タンパク質gp120) と三量体ステム(3 gp41) をコードしており、これらが一緒になってスパイクgp160を構成します。
• RNA ゲノムは、少なくとも7 つの構造マーカー(LTR、TAR、RRE、PE、SLIP、CRS、INS) と9 つの遺伝子(gag、pol、env、tat、rev、nef、vif、vpr、vpu、場合によっては 10 番目の遺伝子) で構成されます。遺伝子 tev は tat、env、rev の融合体であり、19 個のタンパク質をコードしています。
• gag、新しいウイルス粒子の構造タンパク質を作成するために必要な情報が含まれていますpol。env

HIVのライフサイクル

1. HIV と宿主細胞膜の融合後、HIV ビリオンが細胞質に放出されます。
2. HIV ゲノムは二本鎖 DNA に逆転写され、宿主ゲノムに組み込まれます。
3. DNA はプロウイルス的にレトロウイルス mRNA に転写され、翻訳のために細胞質に輸送されます。
4. レトロウイルスの RNA とタンパク質は細胞膜で集合して細胞と融合し、ウイルスを細胞外に放出します。
   

★HIV-1 のライフサイクルにおける主要なステップ

(1) セルに入る

• ① HIV はマクロファージや CD4+ T 細胞の表面糖タンパク質を介して標的細胞受容体に吸着し、その後ウイルスエンベロープが細胞膜と融合し、HIV カプシドを細胞内に放出してマクロファージや CD4+ T 細胞に侵入します。
• ② 細胞に侵入するプロセスは、三量体エンベロープ複合体( gp160 spike、スパイク) とCD4ケモカイン受容体間の相互作用(通常CCR5、 、 、またはその他の相互作用) によって開始されます。Gp160 スパイクには、 CD4 およびケモカイン受容体の結合ドメインが含まれています。CXCR4
• ③インテグリンα4β7gp120と組み合わせることで、ウイルスシナプスの確立に関与する主要なインテグリン（下流シグナル伝達経路）を活性化し、細胞間でのHIV-1の効果的な拡散を促進することができます。LFA-1
• ④ HIV が標的細胞に結合したら、HIV RNA と各種酵素（逆転写酵素、インテグラーゼ、リボヌクレアーゼ、プロテアーゼなど）を細胞に注入します。
• ⑤ HIV は、CD4-CCR5 経路、またはマンノース特異的 C 型レクチン受容体経路(DC-SIGN など)を介して樹状細胞(DC)に感染します。DC は、ウイルスが性行為で感染する際に最初に遭遇する細胞の 1 つです。DCは粘膜でウイルスを捕捉しながらHIVをT細胞に伝達することで重要な役割を果たしていると考えられています。

(2) HIV ゲノムの二本鎖 DNA への逆転写

• ① ウイルスキャプシドが細胞に侵入した直後、逆転写酵素は付着したウイルスタンパク質から一本鎖 (+) RNA ゲノムを放出し、それを相補 DNA (cDNA) 分子にコピーします。
• ②逆転写プロセスは非常にエラーが発生しやすく（逆転写酵素の忠実度が低いため）、薬剤耐性を引き起こしたり、ウイルスが体の免疫系を回避したりする可能性のある突然変異を生成します。
• ③ 逆転写酵素は、 cDNA 合成中にウイルス RNA を分解するリボヌクレアーゼ活性も持ち、アンチセンス cDNAからセンス DNAを生成するために使用されるDNA 依存性 DNA ポリメラーゼ活性も持ちます。
• ④ cDNA とその相補配列はウイルスの二本鎖 DNAを形成し、微小管に沿って核に輸送されます。ウイルス DNA はウイルスインテグラーゼによって宿主細胞のゲノムに組み込まれます。

●逆転写工程

• ①プライマー特定的细胞 tRNAとして機能し、ウイルスゲノムのプライマー結合部位に結合します。PBS
• ② 相補的な DNA を合成し、ウイルス RNA の R 領域（RNA 分子の両端にある繰り返し部分）と U5（非コード領域）に結合します。
• ③逆転写酵素のRNAse Hと呼ばれるドメインはRNAを分解する5'末端ことができるため、R および U5 領域を削除する；
• ④ 次に、プライマーはウイルスゲノム3'端に「ジャンプ」し、そこで新たに合成された DNA 鎖がRNA 上の相補的な R 領域とハイブリダイズします。
• ⑤相補的 DNA (cDNA) の 1 本鎖が伸長され、ほとんどのウイルスRNA は RNAse H によって分解されます；
• ⑥ 鎖が完成したら、ウイルス RNA から2 番目の鎖の合成を開始します。
• ⑦ 次に、 2 番目の鎖の PBS が1 番目の鎖の相補的な PBS とハイブリダイズする別の「ジャンプ」があります。
• ⑧両方の鎖はさらに伸長され、インテグラーゼによって宿主ゲノムに組み込まれることができます。
  

(3) 複製と転写

• ①この組み込まれたウイルス DNA は、 HIV 感染の潜伏期間中は休眠状態にある可能性があります。ウイルスを活発に産生するには、特定の細胞転写因子が存在する必要があり、その中で最も重要なものは NF-κB です ( NFκB)。T細胞が活性化され（他の感染症が発生した場合）、分泌されてウイルスNFκBが複製し始めると、。これは、HIV によって殺される可能性が最も高い細胞は、現在感染と闘っている細胞であることを意味します。
• ② ウイルス複製中、組み込まれた DNA プロウイルスはmRNA に転写され、mRNA はより小さな断片に切断され、これらの小さな断片は核から細胞質に輸送され、細胞質内で調節タンパク質に翻訳されます （これにより、ウイルスの生成がTat促進されます）。新しいウイルス）とRev。
• ③ 新たに生成されたRev 蛋白核が侵入し、核内に蓄積すると、ウイルスの mRNA に結合し、スプライシングされていない RNA が核から出ることができます。本来ならスプライシングまでそこに留まります。
• ④ この段階で、全長mRNAから構造タンパク質Gagと が生成されます。全長 RNA は実際にはウイルス ゲノムであり、タンパク質に結合して新しいウイルス粒子にパッケージングされます。EnvGag

(4) ウイルスの構築と放出

• ① ウイルスサイクルの最終ステップは、宿主細胞の原形質膜から始まる新しい HIV-1 ウイルスの集合です。Env凝集したタンパク質 ( gp160 ) は小胞体を通過してゴルジ装置に輸送され、そこでプロテアーゼによって切断され、2 つの HIVエンベロープ糖タンパク質とに加工されます。 gp41gp120
• ② 糖タンパク質は宿主細胞の原形質膜に輸送され、そこで gp41 がgp120 を感染細胞の膜。Gag(p55)ポリタンパク質は、HIV ゲノム RNAGag-Pol(p160)と同様に細胞膜の内面に結合し、宿主細胞からビリオンの出芽が始まります。
• ③ 成熟は芽の形成中に起こることもあれば、宿主細胞から出芽する未熟なビリオンの中で起こることもあります。成熟中に、HIV プロテアーゼはポリタンパク質を個々の機能的な HIV タンパク質と酵素に切断します。
• ④ その後、さまざまな構造成分が組み立てられて、成熟した HIV ビリオンが生成されます。この切断ステップはプロテアーゼ阻害剤によって阻害される場合があります。成熟したウイルスは別の細胞に感染できるようになります。

● HIV は宿主の免疫反応を弱める

• HIV粒子表面のgp120タンパク質が剥がれ落ち、正常な細胞膜上のCD4受容体に結合すると、免疫系によってウイルス感染細胞と誤認され、死滅します（CD4細胞が減少します）。
• なぜならgp120によってブロックされるT細胞CD4受容体、免疫機能に影響を与えます。
• HIV の gp120 タンパク質は、身体を刺激してCD4 の結合部位に対する特異的抗体を産生し、T 細胞の機能をブロックします。
• ウイルスエンベロープタンパク質を持つ細胞は、他の細胞と融合して、機能を持たない多核巨細胞を形成する可能性があります。

HIV治療

• HAART(カクテル療法):プロテアーゼ阻害剤に基づく治療は1996 年から利用可能になりました。通常、2 つのヌクレオシド アナログ逆転写酵素阻害剤(NARTIまたはNRTI) にプロテアーゼ阻害剤または非ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤を加えます。(ウイルスの逆転写プロセスを阻害しますそのため、ウイルス RNA はゲノムに組み込まれず、逆転写もできませんが、依然として低レベルで複製されます。)
• HAART は患者を治癒させるものではなく、すべての症状を一律に除去するものではなく、治療を中止すると高レベルの HIV-1 ウイルス (多くの場合 HAART 耐性)が再発します。
• 現在の治療を改善するための研究には、現在の薬の副作用の軽減、アドヒアランスを改善するための投薬計画のさらなる簡素化、薬剤耐性を治療するための最適な投薬順序の決定などが含まれます。
• しかし、20 年以上の研究を経ても、HIV-1 は依然としてワクチンの標的となっています。

12.2.2 インフルエンザウイルス (-)ssRNA

インフルエンザウイルス

• インフルエンザウイルスは、周期的に呼吸器疾患のパンデミックを引き起こします。
• RNAウイルス、(-)ssRNA
• サブタイプは、ウイルスの表面に存在する特定の種と2 つのタンパク質 (スパイク) (ヘマグルチニンH1 ～ H18 およびノイラミニダーゼN1 ～ N10) の組み合わせに基づいています。
• 新しい毒性株は、ヒト株と鳥株の組換えによって生成されます。

●ヒト内で流行しているインフルエンザ A ウイルスのサブタイプ

• H1N1 はスペイン風邪と 2009 年の豚インフルエンザの流行を引き起こした
• H2N2は1950年代後半に「アジア風邪」を引き起こした
• 1960年代後半、H3N2は「香港風邪」を引き起こした
• H5N1 は 2000 年代半ばに蔓延し、世界的なパンデミックの脅威と考えられていました
• H7N7には異常な人獣共通感染症の可能性がある
• H1N2 は現在人間と豚の間で流行しています。
• H9N2、H7N2、H7N3、H5N2、H10N7。

●コア粒子: RNA、キャプシドタンパク質、マトリックスタンパク質、スパイクタンパク質を含むエンベロープ

●インフルエンザウイルスのライフサイクル

• インフルエンザウイルスは、セグメント化された (-) 鎖 RNAで構成されています。各フラグメントはヌクレオカプシドタンパク質でパッケージされています。異なる菌株の断片を同時感染によって再結合させました。
• カプシドおよびマトリックスタンパク質は、インフルエンザウイルスのRNA セグメントをブロックします。マトリックスはスパイクタンパク質を含むエンベロープで囲まれています。
• エンベロープタンパク質はウイルスの付着を媒介します。エンベロープタンパク質には、立体構造変化を受けてウイルスエンベロープと宿主細胞膜との間の融合を引き起こす融合ペプチドが含まれる。インフルエンザの場合、ビリオンはエンドサイトーシスによって取り込まれます。
• リソソームとエンドソームの融合( endosome) は、ウイルスエンベロープとエンドソームの融合を引き起こします。次に、ウイルスのゲノムとタンパク質が細胞質に放出されます。ウイルスの(-) 鎖 RNA フラグメントはコーティングされておらず、核に入ります。
• 宿主の mRNA 切断から得られるキャップ付き RNA 断片は、インフルエンザ mRNA 合成を開始します。ウイルスの mRNA は翻訳のために細胞質に戻ります。
• ゲノム RNA 合成はヌクレオカプシドタンパク質によって開始されます( NP)。まず、RNA の (+) 鎖が (-) RNA 鎖の鋳型として合成され、次に新しく合成されたヌクレオカプシドタンパク質にパッケージされて細胞質に輸送されます。
• インフルエンザウイルスのエンベロープタンパク質はERで合成され、細胞膜に輸送されます。
• インフルエンザウイルスは細胞膜上で組み立てられ、キャプシド、間質、(-)鎖RNA成分がエンベロープに包まれています。

12.2.3 SARS-CoV (+)ssRNA

重症急性呼吸器症候群 SARS

●徴候と症状

• 初期症状はインフルエンザに似ており、発熱、筋肉痛、嗜眠症状、咳、喉の痛み、その他の非特異的症状が含まれる場合があります。
• 38°C (100°F) 以上の発熱。
• 息切れは後で現れる可能性があります。
• 初期には風邪のような症状が見られますが、後にはインフルエンザのような症状になります。

●重症急性呼吸器症候群コロナウイルス：SARS-CoV

• プラス鎖(+) ssRNAウイルス
• ゲノム: 27-30 kb、14 ORF
• 3 つの糖タンパク質: S (E2)、M (E1)、およびHE (ヘマグルチニン エステラーゼ)
• S: S1(受容体に結合ACE2) およびS2(膜への取り込みを媒介)
• 直径80～160nm

12.2.4 新型冠状肺炎ウイルス COVID-19 (+)ssRNA

コロナウイルス COVID-19

●現在、感染者数は1億6,300万人を超え、累計死者数は337万人を超えています。
●産地不明。
●症状：

• 熱
• 咳
• 息切れまたは呼吸困難
• チル
• 震える震える
• 筋肉痛
• 頭痛
• 喉の痛み
• 新たな味覚または嗅覚の喪失

●配列：ネパールで分離された2019年新型コロナウイルス（SARS -CoV-2）株の完全なゲノム配列

コロナウイルス

●構造：

• 構造タンパク質: スパイク、エンベロープ、膜、ヌクレオカプシドタンパク質
• 非構造タンパク質

●ヒトコロナウイルスのライフサイクル図
出典：ヒトコロナウイルス：宿主と病原体の相互作用

生物学的ウイルスの応用

1. ファージ(殺菌性) は、特定の病気の予防と治療のための特効薬として使用できます。たとえば、火傷患者は、緑膿菌の希釈液を患部に塗布します。
2. 細胞工学では、センダイウイルスなどの特定のウイルスを細胞融合の融合剤として使用できます（細胞には接触阻害の性質があり、ウイルスの存在下で融合が起こります）。
3. 遺伝子工学では、ウイルスを標的遺伝子のキャリアとして使用し、標的細胞の染色体上で遺伝子をスプライスすることができます。
4. 特定の細菌培養培地にウイルスを添加すると、不純物を除去できます。
5. ウイルスは、精密誘導医療のキャリアとして使用できます。
6. ウイルスは特定の殺虫剤として使用できます。
7. ウイルスはまた、生物圏における物質の循環とエネルギー交換において重要な役割を果たします。
8. ウイルスは、がんなどの病気の治療にも使用できます。

12.3 ウイルスベクター

• 遺伝子導入ベクターはウイルスから作られます。
• 病原性遺伝子が削除され、他のウイルスの効率的なプロモーター配列が挿入されます。
• ベクターの生物学的安全性を向上させるために、ウイルスベクターは、パッケージングと生産に必要なウイルス配列をウイルスタンパク質をコードする配列から分離する形で進化してきました。

●一般的なウイルス発現ベクター

• レンチウイルスベクター ( Lenti Virus)
• アデノウイルスベクター ( AV)
• アデノ随伴ウイルスベクター（アデノウイルス関連ウイルスAAV）
• 逆転写ベクター ( RV)

•アデノウイルスベクターは、宿主ゲノムとは別に環状化し、複製します。
●レトロウイルスおよびレンチウイルスベクターは宿主ゲノムに組み込まれています。
●遺伝子運搬体の安全性：アデノ随伴ウイルス：RG1＞アデノウイルス：RG1＞レンチウイルス：RG2＞レトロウイルス：RG3

12.3.1 レンチウイルスベクターシステム

• ヒト免疫不全ウイルス由来のHIV-1レンチウイルスベクター( );
• 哺乳動物細胞（分裂細胞および非分裂細胞）における遺伝子発現の場合、ゲノムへの組み込み。
• HIV-1 ゲノムには、構造タンパク質や制御タンパク質など、感染サイクルに関与する少なくとも 15 の異なるタンパク質をコードする9 つのオープン リーディング フレームが含まれています。
• ゲノム上には、長い末端リピート( )、TAT 活性化領域( )、スプライスドナー部位およびアクセプター部位、パッケージングおよび二量体化シグナル(ψ)、Rev 応答エレメント( )、中央および末端ポリプリンなど、いくつかのシス作用エレメントが存在します。領域( ) は、さまざまなウイルスのライフサイクルのさまざまな段階での遺伝子発現に必要です。LTRsTARRREPPT

●第一世代レンチウイルスベクター

• ベクターコンポーネント(3 プラスミド):
  (i)パッケージング プラスミド Packaging plasmid; (ii)
  ウイルス糖タンパク質: VSV-Gをコードする Env プラスミド (エンベロープ プラスミド ) ; (iii)トランスファー プラスミド。Env encoding plasmid
Vector plasmid
• 遺伝子工学を使用して、パッケージングシグナル(安全性を向上させるため) またはパッケージングプラスミドの LTR を特異的に削除し、複製感染性レンチウイルス (RCL) の産生を減らします。

●第 2 世代レンチウイルス ベクター

修飾システムの4 つの補助タンパク質コード遺伝子(Vif、Vpu、Vpr、Nef) :第一世代レンチウイルス ベクターパッケージング プラスミド内の HIV のすべてのアクセサリー遺伝子を削除し、これらのアクセサリー遺伝子を除去します。ウイルスの力価やトランスフェクション能力に影響を与えず、同時にベクターの安全性も高めます。

★第三世代レンチウイルスベクター（現在使用中）

• ベクターコンポーネント (4 つのプラスミド)
  (i) 2 つのパッケージング プラスミド(1 つはコード化Rev、もう 1 つはコード化) 、Gagおよび(ii) ウイルス糖タンパク質をコード化する Env プラスミド (エンベロープ プラスミド)、(iii) トランスファー プラスミド。Pol
  
  
• 生物学的安全性がさらに向上：複製感染性レンチウイルス（RCL）の産生が減少します
  ①ベクタープラスミドの5'LTRのU3プロモーター領域を、またはの強力なウイルスプロモーターで置き換えることにより、ベクターから独立したプラスミドを構築します; ②ベクタープラスミド3'LTRのU3 領域配列の欠失により、レンチウイルス粒子は形質導入および標的細胞のゲノム DNA への組み込み後に確実に自己不活化されます(CMVRSVtat
  感染する能力はもうありません。つまり、一度しか感染できません。);
  ③ パッケージング、複製、および形質導入に必要なレンチウイルス遺伝子の数が 3 つに減少します (gag、pol、rev); ④
  Mulv レトロウイルス ベクターと比較して、レンチウイルス ベクターは宿主ゲノム活性に組み込まれる傾向があります。癌原遺伝子サイレンシングを活性化するリスクは、Mulv レトロウイルスベクターよりも低いです。

12.3.2 アデノ随伴ウイルスベクター

• アデノ随伴ウイルスは、一本鎖直鎖状 DNA 欠損ウイルスの一種です。
• ゲノム DNAは 5 kb 未満でエンベロープがなく、形状は裸の正二十面体粒子です。
• AAV は独立して複製できず、複製と細胞溶解性感染はヘルパー ウイルス(例、アデノウイルス、単純ヘルペス ウイルス、ワクシニア ウイルス)の存在下でのみ可能です。

●アデノ随伴ウイルスゲノム

• ゲノムの2 つの端は末端逆方向反復配列( )でITR、中央のゲノムは Rep と Cap という 2 つのタンパク質をコードします。ウイルスの複製とパッケージング
  ITRsにおいて決定的な役割を果たします。このタンパク質はウイルスのカプシドタンパク質であり、ウイルスの複製と統合に関与します。
  Cap
Rep

• AAV はさまざまな種類の細胞に感染します。Repタンパク質の存在下では、ウイルスゲノムはヒト染色体 19の特定の部位に容易に組み込まれます:AAVS1遺伝子座。これが唯一知られている固定小数点積分哺乳類の DNA ウイルスの一種。

• 野生型 AAV-2 のゲノム マップ
  
  (A) Rep および Cap 遺伝子は ITR に隣接しています。異なる Rep および Cap 転写物が、それぞれのプロモーター (P5、P19、および P40) によって生成されます。アスタリスクは、VP3 の生成に使用される代替 ACG コドンを示します。
  (B) AAV-2 ITR の二次構造。RBE(Rep 結合要素、GAGCGAGCGAGCGCGC; RBE'、CTTG) およびTRS(末端分離部位、GTTGG) を示します。ITR は AAV DNA 複製にとって重要です。

● AAV ライフサイクル

• アデノウイルスの同時感染の場合、AAV は感染力を持ち、ゲノム複製、ウイルス遺伝子発現、ビリオンの生成が起こります。
• アデノウイルスが存在しない場合、AAV は19 番染色体 (AAVS1) に組み込まれて潜伏期間を確立できます。
• 潜在的な AAV ゲノムは、アデノウイルスとの重複感染による複製の回復。
• AAV ライフサイクルの両方の段階は、AAV ゲノムと AAV、アデノウイルス、および宿主タンパク質の間の複雑な相互作用によって制御されます。

アデノ随伴ウイルスベクター

a. AAV の概略図。一本鎖ゲノムはタンパク質キャプシドに囲まれています。
b. AAV の DNA ゲノム。4.7 kbゲノムのコーディングrepおよびオープン リーディング フレームcapはITR によって終了します。c. AAV ベクターのコンポーネント。① 治療用導入遺伝子と関連するプロモーターおよびポリアデニル化配列 (polyA) をウイルス ITR の間に挿入します。② ベクターは AAV rep および cap を発現します。③ ベクターはアデノウイルス E2A、E4 および VA を発現します。 RNA略語: AAP、アセンブリ活性化タンパク質、AAV、アデノ随伴ウイルス、ITR、逆方向末端反復、PolyA、ポリアデニル化配列、VA、ウイルス関連。aap

●アデノ随伴ウイルスベクターの利点

• アデノ随伴ウイルスベクター AAV Helper-Free System、アデノウイルスヘルパーベクターを必要としないパッケージングシステム。
• 組換えアデノ随伴ウイルスベクター (rAAV) は、安全性が高く、幅広い宿主細胞に対応できるため、非病原性野生型アデノ随伴ウイルスに由来しています(分裂細胞と非分裂細胞)、免疫原性が低く、生体内での外来遺伝子の長期発現が可能であり、最も有望な遺伝子導入ベクターの 1 つとみなされており、世界中で遺伝子治療やワクチン研究に広く使用されています。

●アデノ随伴ウイルスベクターのデメリット

• AAV ベクターの容量は小さく、現時点では最大4.7 kb の外来 DNA 断片しか収容できません。
• 野生型 AAV は成人の 40% ～ 80% に感染性があり、ワクチンの製造には役立たないため、アデノウイルスの存在下で免疫拒絶を引き起こす可能性があります。

● AAV発現に適した遺伝子

1. 治療用遺伝子の長さは長すぎてはいけません。AAVの総容量は4.7kbで、AAV 独自の ITR、プロモーター領域、RNA テーリング シグナルを含む；
2. 遺伝子は継続的に発現する必要があり、タンパク質は分泌される場合と分泌されない場合があります。
3. 有毒な副作用を伴わない標的遺伝子の長期発現。
4. 標的遺伝子を即座に発現させる必要はありません。
5. 遺伝子の高レベルの発現は必要ありません（ウイルスベースの発現ベクター、発現レベルは低くなります）；
6. AAV ベクターは、標的細胞に対する高い形質導入効率を備えています。

12.3.3 単純ヘルペスウイルスベクター

単純ヘルペスウイルス HSV : DNAウイルス

• 単純ヘルペスウイルスは、口や性器の粘膜に再発性のただれを引き起こすウイルスです。最初の感染は口腔または生殖器との接触を介して起こり、その後、神経節ニューロンで潜在的に再活性化されたウイルスが発生します。
• ヘルペスビリオンには、正二十面体のキャプシドにパッケージされた二本鎖 DNAゲノムが含まれています。カプシドは多くのマトリックスタンパク質とエンベロープで囲まれています。
• HSV の付着には複数の受容体が関与している可能性があります。
• 微小管足場はヘルペスビリオンを核に輸送し、DNA ゲノムに挿入します。HSV の集合は核膜または他の膜で起こります。ビリオンはエキソサイトーシスによって細胞から放出され、急速な放出は粘膜病理を引き起こします。
• HSV の DNA ゲノムは丸め法( rounding 法)により合成されました。高い複製効率）、ウイルスおよび宿主が生成する成分を補充したウイルス DNA ポリメラーゼを使用します。
• 感染性 mRNA の発現により、キャプシド、マトリックス、およびエンベロープタンパク質が生成され、それによって HSV が構築されます。
• LATタンパク質の発現は、多くの場合、DNA サイレンシングが数か月または数年間持続する神経細胞の潜伏感染につながります。

単純ヘルペスウイルスベクター

●アンプリコン システムには以下が含まれます。

1. Ori単純ヘルペスウイルス (HSV) の DNA 複製起点 ( )、HSVパッケージング配列( Pac)、抗生物質耐性遺伝子 ( Amp) およびプロモーター導入遺伝子カセットを含むアンプリコン プラスミド。
2. ウイルス複製機能を提供するヘルパーウイルス。

●パッケージングシグナルを削除したヘルパーウイルスのゲノムを細菌の人工染色体にクローン化する( BAC)。
●真核細胞をアンプリコンと HSV-BAC DNA で同時トランスフェクトすると、得られるウイルス粒子はアンプリコン プラスミドのみを認識してパッケージングできるため、ヘルパー ウイルスを含まないアンプリコン ストックが得られます。

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課題: SARS-CoV2 (細胞外に分泌される) の S タンパク質の核酸配列を見つけ、それを真核生物発現ベクターに構築して細胞外に分泌および発現できるようにします。プライマーを設計し、設計スキームを説明する必要があります。
細胞の外側に分泌される: 分泌ペプチドは S タンパク質に融合され、分泌ペプチドの後ろの同じフレーム内に配置されます。

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