3 простых и практичных онлайн-программы для разработки праймеров для ПЦР

1. NCBI Primer-Blast

• Этот инструмент объединяет популярное в настоящее время программное обеспечение Primer3, а также Blast от NCBI для проверки специфичности праймеров; праймеры могут быть разработаны для конкретного гена варианта сплайсинга.
• URL-адрес: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/ или непосредственно с домашней страницы Blast ( http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/ ).
• Интерфейс Primer-Blast состоит из 4 частей :
  ◆ Шаблон ПЦР (область шаблона)
  ◆ Параметры праймера (область параметров праймера)
  ◆ Выбор экзона/интрона (настройки экзонов и интронов)
  ◆ Проверка специфичности (область проверки специфичности)

1. Дизайн праймеров , ввод шаблона мишени, номер доступа / номер Gi / формат FASTA.
   

2. Проверить праймеры

3. Exon intron: Если разработанный праймер охватывает место соединения интрона и экзона , его можно установить здесь Primer must span an exon-exon junction. Такие настройки, как количество совпадающих оснований экзона и длина интрона, обычно выбираются по умолчанию .

4. Проверка специфичности выбирает целевую базу данных и виды при разработке праймеров или проверке праймеров . (Важно)
   ◆ Предоставляется семь баз данных: RefSeq mRNA, Genome (эталонные сборки выбранных организмов), RefSeqрепрезентативные геномы, RefSeq РНК (refseq_rna), nr (стандартная неизбыточная база данных), Genome (хромосомы всех организмов) и пользовательские.
   ◆ Первые две базы данных представляют собой экспертные аннотированные данные , которые могут дать более точные результаты.
   ◆ В частности, когда вы используете эталонную последовательность NCBI в качестве шаблона и базу данных эталонных последовательностей в качестве стандарта для разработки праймеров, Primer-BLAST может разработать специальные праймеры, которые амплифицируют только определенный ген варианта сплайсинга .

5. Рекомендуется использовать олиго6 или праймер5 для проверки характеристик самого праймера: структуры шпильки, самодимера праймера, несоответствия и димера между праймерами, а также абсолютного значения △G.

2. Праймер3 Плюс

• Строгий дизайн праймера для количественной ПЦР обычно требует, чтобы один из праймеров охватывал экзон, и лучше всего создавать праймер на 3'-конце, а длина продукта должна быть в пределах 300 п.н. Это онлайн-программное обеспечение может удовлетворить требования к дизайну праймера для количественной ПЦР. http://www.primer3plus.com/

• 1. Main: Разумное использование символов <排除的区域>, ［目的扩增区域］, ｛包含的区域｝делает дизайн праймера отвечающим вашим собственным требованиям.
  

• 2. General Settings: Избегайте множественных повторяющихся оснований и избегайте 4 или более 4 G в последовательности праймера.
  Установите параметры в соответствии с требованиями флуоресцентных количественных праймеров, такие как:
  длина продукта : не должна превышать 400 п.н., предпочтительно 100-150 п.н.,
  GC% : 30%-70%, предпочтительно 45%-55%,
  длина праймера : 18-25 п.н. предпочтительно 22-24 п.н.;
  значение TM : 58-60°C, предпочтительно 60°C;
  3'-конец : по крайней мере 4 основания на 3'-конце являются консервативными, предпочтительно T, C, G.
  

• 3. Нажмите зеленую кнопку в правом верхнем углу Pick Primers, чтобы получить несколько пар праймеров, которые включают некоторые основные параметры праймеров и продуктов в порядке от 5 до 3 футов. В соответствии с требованиями флуоресцентных количественных праймеров попробуйте выбрать для синтеза праймеры, оканчивающиеся на G и C, как показано в красной рамке на рисунке ниже, а также вы можете увидеть положение праймеров на диаграмме последовательности.
  

• 4. После разработки праймеров проверьте праймеры NCBI для взрыва , введите http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi и введите восходящие праймеры в порядке 5–3 футов в поле ниже. и нижестоящие праймеры, интервал между вышестоящими и нижележащими праймерами составляет более 20 н .
  

• 5. Выберите базу данных видов , например «Человек», «Мышь» или «Другие» (если это не человек и не мышь).
  

• 6. ВыберитеSomewhat similar sequences (blastn)
  

• 7. Щелкните Algorithm parameters, Expect thresholdвведите 1000 в поле и 7Word Size в поле . Размер слова не означает размер шрифта, а следует понимать длину считывания , которая заносится в GeneBank для сравнения по набору из 7 нуклеотидных последовательностей.
  

• 8. Нажмите, чтобы BLASTначать сравнение, и появится результат, а цвет представляет оценку.
  Принцип подбора праймеров таков : большую часть списка составляет целевой ген, что указывает на высокую специфичность праймера, однако виды могут быть разными, что указывает на консервативность гена у разных видов.
  
  

3. Грунтовка банка

• PrimerBank — это база данных праймеров для количественной ПЦР Гарвардского университета, в настоящее время содержащая более 200 000 праймеров, охватывающих большинство известных генов человека и мыши. По результатам проверки более 20 000 пар праймеров на сайте показатель эффективности праймеров составляет 82,7% . Попробуйте выбрать такие проверенные праймеры для qPCR, качество qPCR относительно гарантировано. http://pga.mgh.harvard.edu/primerbank/

• Тип поиска Здесь можно выполнить поиск по шести параметрам: доступ к GenBank, доступ к белку NCBI, идентификатор гена NCBI, идентификатор банка праймеров, символ гена NCBI и ключевое слово. Возьмем, к примеру, бета-актин у мышей .
  

• 1. Найдите идентификатор гена β - актинаNCBI-Gene на , нажмите на классификацию справа , и появится результат. актин.mus musculus

• 2. Введите в банк праймеров 11461. В этом результате мы можем увидеть идентификатор гена NCBI, доступ к GenBank, доступ к белку NCBI, длину кодирующей ДНК и другую информацию о бета-актине . Введите символ гена NCBI бета-актина: Actb, вы также можете получить тот же результат.
  

• 3. Потяните вниз, чтобы увидеть проверенные праймеры :
  

• 4. Нажмите, чтобы увидеть кривую плавления, результаты электрофореза и другую информацию: