Mol Cell Proteomics | Identification of an Unconventional Subpeptidome Bound to the Behc¸et’s Disease-associated HLA-B*51:01 that is Regulated by Endoplasmic Reticulum Aminopeptidase 1 (ERAP1)
期刊：Molecular & Cellular Proteomics
发表时间：May 16, 2020
通讯作者：Liye Chen
一. 概述
贝赫切特病（Behc¸et′s disease，BD），又称白塞病，是一种慢性炎症性疾病，其特征为炎症性关节炎。人类白细胞抗原（HLA）B * 51：01和内质网氨基肽酶1（ERAP1）在遗传上与Behc¸et′s病（BD）密切相关，但致病机制仍不清楚。之前的研究已发现HLA-B * 51肽组位置2（P2）上含有脯氨酸（Pro）或丙氨酸（Ala）的两个亚组，但对于非Pro/Ala2的结合 HLA-B * 51的肽了解甚少。本文旨在研究非Pro / Ala2 HLA-B * 51结合肽这种新型亚肽组的功能，并探究ERAP1对其的调控。最后，本文鉴定了丰富的非Pro/Ala2 HLAB * 51:01亚肽组，发现其与ERAP1的表达呈正相关。同时还发现，ERAP1以细胞类型依赖性方式调节HLA-B * 51细胞表面表达。这些发现为ERAP1和HLA-B * 51在BD中的致病作用提供了新的见解。
二. 研究背景
BD是一种全身性免疫系统疾病，可侵害人体多个器官，包括口腔、皮肤、关节肌肉、眼睛、血管、心脏、肺和神经系统等。人类白细胞抗原（HLA）B+51：01和质内视网膜氨基肽酶1（ERAP1）与BD具有强烈的遗传关联。本研究使用仅表达HLA-B * 51：01的新型经CRISPR-Cas9处理生成的HLA-A，B和C基因敲除HeLa细胞系，发现非Pro / Ala2亚肽组中包含20％的HLA-B * 51：01结合肽。这种非常规的亚肽组在肽长度和基序方面不同于Pro2和Ala2肽。为了研究了非Pro/Ala2，Pro2和Ala2这三种肽的特征及在ERAP1沉默后的改变，本研究用慢病毒shRNA沉默ERAP1后，洗脱结合至HLA-B*51：01的肽，并通过质谱分析。结果发现ERAP1敲低会增加非Pro / Ala2肽的频率并降低Pro2肽的频率：Ala2和非Pro/Ala2的长度和基本序列会受到影响，但Pro2与HLA-B * 51：01的结合肽不会。
使用流式细胞仪研究了ERAP1沉默对HLA-B * 51：01细胞表面表达的影响。从HLA-B * 51：01洗脱的结合肽中，有超过20％的P2位上缺少Pro或Ala。研究发现，与Pro2和Ala2亚肽相比，非Pro/Ala2亚肽组以8聚体居多（9聚体相对较少），并且N末端和C末端残基的用法与Ala2肽相似。当ERAP1被敲低后可使非Pro/Ala2的比例从20％增加到40％，增加了从HLA-B * 51：01复合物中洗脱的更长肽（10-mer和11-mer）的比例。最后，本研究还发现，ERAP1沉默后以细胞类型依赖性方式调节细胞表面HLA-B * 51的表达水平。
三. 实验设计
四. 研究结果
1. 鉴定到非常规HLA-B_51：01亚肽
在两次生物学重复的实验中，鉴定到了非Pro / Ala2的HLA-B * 51亚肽（A,B,C）。
2. 非 Pro/Ala2的HLA-B_51：01 亚肽在 P1 和 P 上具有特征长度分布和残留作用
Pro2、Ala2 和非 Pro/Ala2 肽的长度（A），其中非 Pro/Ala2 肽的长度以8聚体和9聚体为主；非Pro/Ala2肽的N端（P1）残留与Ala2肽非常相似（B）；非Pro/Ala2肽的C端的亮氨酸含量较其他两种肽明显减少（C）。
3. 降低ERAP1的表达致HLA-B+51 的长结合肽的百分比增加，生成N和C端的扩展肽
与HLA-B+51结合的肽从复合物中洗脱，所识别的肽的数量和长度分布在（A）和（B）中显示。有N和/或C端子扩展肽的总肽数及分类显示在（C）中。
4.ERAP1的沉默增加了Ala2和非Pro/Ala2肽的长度，但没有增加Pro2的肽长度
5.ERAP1 以与细胞类型相关的方式调节 HLA-B_51 细胞表面表达式。
已知ERAP1调节MHC I类细胞表面表达，有研究显示在ERAP1沉默或抑制后，HLA-B * 27 2-微球蛋白-无重链（FHC）细胞表面表达降低。 因此，本文欲进一步研究ERAP1对HLA-B * 51表达的影响。最终发现，被HC-10染色的HLA-B * 51 FHC通过在HeLa.ABC-KO.B51细胞中敲低ERAP1而增加（图A）。同时，在两种人类B淋巴母细胞系221.B51和C1R.B51中，发现在ERAP1沉默后FHC减少（图B和C）。值得注意的是，在HeLa.ABC-KO.B51细胞中，经典HLA-B * 51的细胞表面表达不受ERAP1沉默的影响，但在221.B51和C1R.B51细胞中，整体HLA I类水平降低了。HeLa细胞系和B细胞系（221和C1R）细胞系之间的这些不同结果表明ERAP1对HLA-B * 51：01表达具有细胞类型依赖性的作用。
文章亮点：
总体而言，本研究通过使用了较新的方法来鉴定非Pro / Ala2 HLAB * 51:01亚肽，这种亚肽不常见但却十分丰富。它的数量及长度易受与BD密切相关的ERAP1基因表达的影响，且两者的表达量呈正相关。本研究还进一步拓展研究了其他ERAP1相关的MHCI类细胞系，通过对比发现，ERAP1以细胞类型依赖性方式调节HLA-B * 51细胞表面表达。以上这些发现为ERAP1和HLA-B * 51在BD中的致病作用提供了见识。
文章链接: https://www.mcponline.org/content/19/5/871
doi: https://doi.org/10.1074/mcp.RA119.001617
解读人：Mengru Yang