题目：Quantitative Profiling of the Human Substantia Nigra Proteome from Laser-capture Microdissected FFPE Tissue
期刊：Molecular & Cellular Proteomics
发表时间：March 4, 2020
DOI：10.1074/mcp.RA119.001889
分享人：廖文丽
内容与观点：
一、概述
激光捕获显微分离技术（LCM）可以从非均质组织中可视化和分离形态不同的细胞亚群，与福尔马林固定和石蜡包埋（FFPE）组织结合使用可以作为回顾性临床相关研究提供强有利的工具。研究优化了适用于FFPE标本的有效LCM分析的实验方案，然后使用TMT标记和LC-MS/MS对显微分离的FFPE人黑质组织样本（约3000个细胞）进行分析，定量了超过5600个蛋白质。黑质蛋白质组通过丰度进行分类，细胞外囊泡和神经元特异的GO项中显示出较高的蛋白丰度；使用非标记蛋白质组将显微分离的样品与完整的组织切片进行比较，发现显微分离的样品中神经元细胞类型的标记物较丰富。
二、研究背景
福尔马林固定和石蜡包埋（FFPE）组织是进行回顾性临床研究的金矿。样品没有传染性，可以在室温下保存数年，并保留组织的结构和形态。福尔马林固定通过甲醛与核酸，多糖和蛋白质侧链的交联来保存组织。但是，这些与甲醛的交联和修饰导致蛋白质和RNA / DNA的提取不良。因此，对于随后的生化分析，需要将交联反向，这可以通过加热（“抗原回收”）来实现。不同实验室在固定时间，福尔马林浓度，温度和pH方面使用的方案有所不同，影响了组织标本的质量并影响了从FFPE组织中提取蛋白质的效率。除了加热样品外，还使用了不同的提取缓冲液来实现有效的蛋白质提取。
组织切片是包括不同细胞数量中的不同细胞群体的异质混合物。激光捕获显微分离技术（LCM）是一种强大的技术，可用于在形态学背景下从异质组织中可视化并分离出不同的细胞亚群。LCM使细胞富集并分析特定细胞亚群中的蛋白质表达。
黑质是位于中脑的一个区域，其中含有棕色色素颗粒（“ neuromelanin”），这些颗粒是多巴胺能神经元的一部分。这些神经元在黑质致密部中的丢失是帕金森氏病的标志。因此，一些研究已经分析了黑质蛋白质组和比较样本与患病者健康供者。总体而言，每个研究最多鉴定出1795种蛋白质。但是，这些先前的研究并未涉及样品分级分离以提高分析深度。此外，它们是用冷冻组织进行的，而FFPE组织材料提供了更好的组织形态，从而可以更精确地鉴定并最终分离靶细胞。
三、实验设计
1. 优化用于提取FFPE组织中蛋白质的缓冲液
2. 显微分离与组织切片法的黑质蛋白质组比较分析
3. 评估显微分离样本在五个批次中的变异系数
四、 研究成果
1. 从FFPE组织中提取蛋白质
比较了包含2％SDS，1％SDC或0.2％Rapigest的三种不同的蛋白质提取缓冲液，以优化提取蛋白质的量和蛋白质/肽鉴定的数量。与Rapigest和SDC缓冲液相比使用SDS缓冲液鉴定出更多的蛋白质组（> 20％）和唯一肽段肽（> 30％）（图1A），维恩图比较了不同提取缓冲液鉴定出的蛋白质，发现在所有样品中63％的蛋白质是相同的（图1 B）。所有鉴定出的蛋白质中将近17％仅存在于SDS提取缓冲液的样品中。SDS缓冲液的漏切比例比在其他两种缓冲液中更高（图1 C）。四个技术重复样本的变异系数在16％至18％之间，所有三个缓冲液的变异系数均相似（图1 D）
2. SP3酶解法优化
由于SDS会干扰蛋白质消化和MS测量，因此在胰蛋白酶消化之前需要清洗样品以除去SDS。这是使用SP3酶解方法完成的。但是，使用原始方法时，会发生大量样品丢失。因此，优化了蛋白质和肽的洗涤步骤。在蛋白质洗涤步骤中，确定了最优的条件为PH8，70%乙腈；在肽洗涤步骤中，确定了最优的条件为1%FA，95%乙腈。总体而言，通过对原始方案进行优化，两个洗涤步骤的蛋白质和多肽的回收率均分别提高了20%和60%。
3. 与完整组织切片相比，显微分离样品中神经元特异性蛋白的富集
激光捕获显微切割技术可从非均质组织标本中纯化细胞亚群。因此，使用这种技术可以富集较小的细胞亚群。在这里，我们将来自黑质组织样本的完整解剖切片与完整切片进行了比较，以测试LCM的效率。对于五名健康供体中的每一个，使用无标记shot gun MS方法分析了用LCM分离的完整组织切片和3000个细胞。
在火山图(图2A) 中显示，大量显微切割样品中的蛋白强度较低。但是，182种蛋白质显示出至少2倍的蛋白质强度增加。与人类蛋白质组相比，这些蛋白质的生物信息学分析表明，神经元特异性GO细胞成分较丰富，包括突触，神经元投射和树突（图2 B）。相反，与整个组织切片相比，736种蛋白质的强度最低低至二分之一。这些富含GO成分核糖体和核小体，以及细胞外囊泡，膜和胞质溶胶（图2 C）。如图2 d所示，与相应的组织切片相比，在大多数供体的显微分离样本中，神经元特异性蛋白的检测强度更高。例如，存在于黑质组织中的多巴胺能神经元标记酪氨酸羟化酶在供体2中富集约8倍。α-突触核蛋白（SNCA）是路易小体的组成部分，是帕金森氏病的病理标志。这种疾病在供体3和5中高出2.5倍。酪氨酸蛋白磷酸酶非受体5型（PTPN5）是一种富含脑的蛋白质，参与突触可塑性的调节，在所有供体中均显着富集，最少8例。显微切割后样品的强度提高了两倍。蛋白磷酸酶1调节亚基1B（PPP1R1B）是一种多巴胺和cAMP调节的神经元磷酸蛋白，平均增加约12倍。
4. 黑体蛋白质组的功能富集
基于它们的强度（平均所有供体的），划分为四部分（图3A）。将每个部分的蛋白质与GO细胞成分和生物学过程以及Kegg途径相关联。关于GO生物学过程，参与RNA剪接，线粒体翻译和自噬的蛋白质富含第3和第4部分，而TCA循环，黑质形成和神经递质分泌则富含第1部分（对应于最高丰度的蛋白质）（图3 B）。来自细胞外囊泡的蛋白质和带有几种神经元特异性GO细胞成分（例如髓鞘，突触，神经元投射，树突，轴突和突触小泡）注释的蛋白质也富含第1部分（图3 C和3 D）。来自溶酶体和反高尔基体网络的较低丰度蛋白质富含四分第3和4部分。Kegg途径的注释揭示了较低丰度蛋白质中剪接体和磷脂酰肌醇信号系统的蛋白质富集，而突触囊泡周期，多巴胺能突触则丰富。第1部分中的富集途径包括TCA循环和氧化磷酸化。
综上所述，作者提出了一种用于激光捕获蛋白质组学的优化实验方法，该方法使用少量的FFPE组织进行了激光捕获蛋白质组学研究，该方法已应用于人类黑质样本。我们通过比较不同的缓冲液并优化了蛋白质提取步骤，并通过将完整切片和显微分离样品进行比较，显示了LCM的效率。具有所有不同细胞群的黑质（而不是酪氨酸羟化酶阳性神经元）被用于此方法开发研究。该研究是迄今为止所报道的人类黑质最详细的蛋白质组学数据集。作者注意到，在帕金森氏病中，多巴胺能神经元的丢失发生在黑质中，而腹侧被盖区的人对变性的抵抗力更大。因此，将来在帕金森氏病期间区分两个大脑区域的神经元并分析其蛋白质组将非常重要。现在建立的激光捕获蛋白质组学方法现在可以用于在病理情况下分析多巴胺能神经元的蛋白表达。