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1. サンプルの準備
- ① 溶解:
◆細胞:培養上清を捨て、滅菌 PBS で 1 ～ 2 回洗浄し(培地中の血清にはタンパク質が豊富に含まれているため、細胞および培養皿の表面に残った培地を除去します)、細胞を添加します。ライセート（80～100μl/60mmディッシュ）とプロテアーゼ阻害剤をシェーカー上で振盪して溶解し、いつでも観察します。氷上で溶解するのが最善です(シェーカーにアイスボックスを置き、シャーレをアイスボックスに置きます)。
◆組織：組織ブロックを適当な大きさに切り、滅菌PBSで1～2回洗浄し、細胞溶解液とプロテアーゼインヒビターを加え、高速ホモジナイザーでホモジナイズ（低温ホモジナイザー：2ml平底EPの外側）破砕用のハイスループット組織破砕器具（事前にライセートを予冷し、破砕プロセスをいくつかのセクションに分割し、各小セクションの破砕時間を短縮し、組織の入った EP チューブを壊れた隙間に置きます。次の短い粉砕プロセスの前に、砕いた氷の中に埋めて数分間冷却します。最高の低温割れ。 - ② 破片を除去します（細胞または組織を完全に溶解した後、ライセートに完全に溶解できない細胞破片が存在するため、除去する必要があります）：12000rpm、10〜20分間、4℃で遠心分離し、上清を取ります。（遠心分離後、細胞破片がチューブの底に沈み、上清が抽出されたタンパク質です）
- ③ タンパク質の定量: BCA 法を使用してタンパク質濃度を測定し、分注します。
- ④ タンパク質変性: ローディングバッファーを加え、沸騰したお湯で 5 分間煮沸します。（EPチューブのキャップは沸騰した湯煎で簡単に洗い流せます。コンタミネーションを防ぐため、金属浴やPCR装置を使用してタンパク質を変性させることもできます。）
- ⑤ 保存: 変性タンパク質サンプルは分注して -20℃、長期保存は -80℃で保存してください。溶解が完了したらすぐに -80°C で凍結することもでき、断片化解除、定量、変性などの後続のステップのためにサンプルを集めた後にサンプルを取り出すこともできます。
- 推奨試薬:
△碧云天，Western 及 IP 细胞裂解液（P0013）切断
△Pierce™ BCA Protein Assay Kit（23227）タンパク質濃度測定、96 ウェル プレート + マイクロプレート リーダーの使用を推奨、試薬を節約 (ウェルあたり 200 ul BCA 作業溶液)、手間と時間を節約 (マイクロプレート リーダーをスキャンし、データを Excel に貼り付け、濃度各タンパク質の濃度を計算でき、最初の計算のためにテンプレートを保存でき、次回からはテンプレートにデータを直接入力して各チューブの濃度と体積を取得できます。
BCA標準音楽制作：（公式マニュアルの操作はさらに複雑なので、簡単に説明します） キットに付属するBSAスタンダードの濃度は2ug/ulで、標準曲線の勾配が設定されています：7ウェルを準備し、20ウェルを追加します。各ウェルに 19、18、17、16、15 の順で、14 μl の脱イオン水、0、1、2、3、4、5、6 μl の BSA 標準を加えたので、得られた標準タンパク質ポイントは 0、2、4、 6、8、10、12 ug (一般的なライセートタンパク質抽出範囲をカバーできますが、超高濃度のタンパク質は適用できません)。
△Sigma，Sample Buffer, Laemmli 2× Concentrate（S3401）タンパク質は変性しており、タンパク質は底によく沈み、浮きにくく、サンプルはスムーズにロードされます。短所: 2倍であるため、タンパク質濃度が高いサンプルにのみ適しています。通常のタンパク質抽出にはBiyuntian（国産）のローディングバッファーも使用できます。
2. SDS-PAGE ゲルの調製と電気泳動分離
2.1 接着剤の充填
- ① ガラス板の洗浄: ガラス板にはさまざまな仕様があり、さまざまな厚さの PAGE ゲルを作成できます。接着剤の作成に適したガラス板を選択する必要があります。イオン水で数回洗浄し、ガラス片を立て掛けます。ワイヤーバスケットは水垢が付かないように注意しながら自然乾燥させます。
- ② プラスチックフレームの組み立て：ガラス板をペアにして（1つはガラスが直角になった厚い板、もう1つは滑らかな薄い板）、ペアのガラス板を位置合わせし、2枚のガラス板の下端を同じ位置に保ちます。同レベル接着ブラケットを固定し、固定フレームに取り付けます。接着ブラケットの締まり具合（きつさ）、接着固定枠のクリップのバネの弾性（きつさ） 、固定枠のゴムストリップがきれいで弾力性があるかどうかに注意してください。接着剤を注ぐときは、漏れがないか常に注意してください。わずかな漏れがある場合は、上の写真に示すように、1 ml ピペット チップをホルダーにクランプし、ホルダーのクリップを人為的に締めることができます。。漏れがひどい場合は、何もすることができず、セットを再度組み立てるしかありません。それで同時に複数のピースを一致させるのが最善です。使用できるピースが常に 1 つあります。。
- ③ 接着剤の準備：ウエスタンで使用される PAGE ゲルは不連続で2 層に分かれており、上層がスタッキングゲル、下層が分離ゲルです。混合する際は、下層の分離ジェルを先に混合してください。500μlの無水エタノールで接着剤を押し付けます（水圧よりも優れています）, 分離ゲルが固まったら無水エタノールを捨て、エタノールが揮発した後、イオン水を注いでたエタノールを洗浄し、上層の積層ゲルと合わせます。スタッキングゲルはある程度の高さが必要で、サンプルウェルの底から分離ゲルまでの距離は通常1～2cm程度が適当です、距離が近すぎると圧力が十分にかかりません、距離が近すぎると圧力がかかります。長くすると分離ゲルが短くなり、タンパク質の分離に影響します。
- ④ コーム挿入: コームは接着剤の厚さやサンプル量に応じて仕様が異なりますので、注意が必要です。層状接着剤を注いだ後、すぐにコームを挿入します。この動作は迅速でなければなりません。そうしないと、サンプルの穴が変形しやすくなります。コームを挿入するときは、未固化のアクリルアミドが有毒であるため、厚いわら紙でそれをブロックするのが最善であり、コームを挿入するときに顔にスプレーしやすいため、保護に注意してください。完全に重合してゲルになっているポリアクリルアミドの方が安全です。そのため、残った接着剤を廃棄する場合は、完全に固まるのを待ってから廃棄してください。時々、コームが外れてサンプル穴の間のスペースが不安定になる場合は、コームを挿入する動作が遅いと考えられます。
- ⑤ コームを引き抜く：ラミネートゲルが固まった後、急いでコームを引き抜かず、ガラス板・接着剤・コームのセットを丸ごと取り外し、電気泳動槽に入れ、電気泳動液を注ぎ、電気泳動液にはSDSが含まれており、コームを引き抜く際にスムーズな動きを実現します。
- SDS-PAGE接着剤の配合：
△ 表の最後は一般的な計算式X%で、 30％アクリルアミドの量でddH 2 Oの量を調整します。△ 10% APとTEMED はアクリルアミドの重合TEMED は 4℃で長期保存可能ですがを
2.2 電気泳動による分離
- 原理:サンプルは 5% スタッキングゲル内で細い線に圧縮されます。これは緩衝液中のグリシン酸イオンGly-および Cl-の影響です。スタッキングゲルでは、Cl - が先頭、タンパク質サンプルが中央、Gly -塩イオンが最後に流れ、Gly -と Cl -の間に電圧勾配が形成され、タンパク質サンプルが圧縮されます。分離ゲル、Gly -、Cl -タンパク質の前を走ると、タンパク質サンプルは電圧勾配の限界を超え、タンパク質のサイズに応じて異なる速度で泳ぎ始め、それによってタンパク質のサイズに応じて分離します。タンパク質。
- 積層ゲル濃度：約５％、ｐＨ６．８。
- 分離ゲル濃度: 7.5-15%、pH 8.8。分離ゲルの濃度が異なると、タンパク質サンプルの分離能力も異なります。濃度が低いほど分離は良好になりますが、小さなタンパク質は逃げやすいため、通常は 10 ～ 12% が使用されます。
- 電気泳動時の注意事項：
① SDS-PAGE はイオンに弱いため、泳動液の調製には純水を使用し、泳動槽および泳動液の入った容器も純水。
②サンプルをロードする前に、インスリン針でサンプル穴をフラッシュします。
③ 前日に電気泳動液を調製し、よく混ぜて 4℃に置き、使用するときは電気泳動槽を少し傾けて、電気泳動液を槽内壁に沿ってゆっくりと注ぎます。PAGE ゲルの下端に気泡がないことを確認できます。（電気泳動液には SDS が含まれています。調製してすぐに使用すると、SDS で発生した泡が PAGE ゲルの底に溜まるなど、電気泳動に影響を及ぼし、レーンごとに差が生じます。） ④ タンパク質をゆっくりと添加します。
サンプルをウェルと各ウェルの上部に注入します サンプル量を一定に保つことが最善です。タンパク質を含まないウェルにもローディングバッファーを加えて同じ量にすると、出てくるタンパク質バンドがより均一になります。タンパク質バンドは小さなウェルまたは空のウェルに浮遊します。あらかじめ染色したタンパク質マーカーをウェルに置くことを忘れないでください。
- 推奨試薬：
△天能（国産高品質品）、SDS-PAGEゲル作製ブラケット、ゲル作製固定枠、コーム、ガラスプレート
△ゲルの母液や泳動液を調製したくない場合は、を推奨します迪生（製品の品質が安定していますSDS-PAGE stocking buffer）TGS buffer。
△ あらかじめ染色されたタンパク質マーカーがThermo Scientific使用可能ですPageRuler™ Plus Prestained Protein Ladder, 10 to 250 kDa（26619）。
3.転写フィルム
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ウェット転写とセミドライ転写の2種類があります。
ウェット転写：大量の転写液に全体を浸します。スポンジパッド、ろ紙、接着剤、PVDF 膜、ろ紙、スポンジパッドのサンドイッチを、負極から正極に向かって転写フィルムタンクに垂直に挿入します。セミドライ転写: 少量の転写液でサンドイッチの湿り気を保ちます。セミドライ式移送装置は水平で、上が陰極、下が陽極であり、スポンジパッドはなく、ろ紙が電極板に直接取り付けられている 陽極から陰極へ、順序は、プラスの金属プレート、濾紙、PVDF 膜、接着剤、濾紙、マイナスの金属プレート、プラスチック キャップです。
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ウェット転写とセミドライ転写のサンドイッチ作製と転写液配合：
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お勧め：
GE，PVDF 膜（A10074129） -
メンブレン転写の注意点： ① NC 膜結合タンパク質の結合効率が 80 ～ 100 ug/cm 2程度であるのに対し、PVDF メンブレンは 155 ～ 300 ug/cm に達するため、
タンパク質結合効率の高いPVDF メンブレンの使用をお勧めします。２．② メンブレンを転写する場合は、プレートを 2 枚用意し、大きいプレートには転写液を、小さいプレートには適量のメタノールを注ぎます。ガラス板から糊を剥がし、重ね合わせた糊の部分を切り取り、糊と同じ大きさの濾紙も転写液に浸し、転写液に浸します。カットしたPVDF 膜を急いでメタノールに浸すのではなく、メタノール液面に 10 秒間静かに浮かべます(この 10 秒の間、メタノールは PVDF 膜を活性化するのに十分であり、膜の活性化に注意する必要があります)。 PVDF 膜。最後にそれを殺すことはできないので、最初にサンドイッチを作り始めることができます。
PVDF 膜を添加する場合は、膜をメタノールに投入して活性化させます。、起動するとすぐにサンドイッチにロードされます。
③ サンドイッチを作るときは、ガラス圧延棒を使用するか、清潔で滑らかなガラス試験管を使って膜と接着剤の間の気泡を削り取る必要があります。
④ ウェット転写条件は通常午後 10 時に設定され200mA 恒流，2.5-3h、比較的長い時間であり、発熱がフィルムの転写効果に影響を与えるため、発熱を制御する必要があります。砕いた氷で満たされた大きなアイスボックスを用意し、水を加え、転写フィルムタンクを氷と水の混合物に埋めて冷却するのが最善です;また、転写フィルムタンクに磁気ローターを追加して、アイスボックスと転写フィルムタンクを磁気スターラー上で再度かき混ぜて回転させるか、転写タンクを直接4°C の冷凍庫に入れて冷却します。
Boleの転写フィルム タンクは非常に高温であるため、制御する必要がありますが、Pharmaciaの転写フィルム タンクは熱制御が優れており、まったく熱を発生させません。
⑤ セミドライサンドイッチは湿った状態に保つ必要がありますが、サンドイッチの周りの金属板は乾いた状態に保つ必要があります。
⑥セミドライ転写の条件は を使用することです恒压 20V，20min-1h。タンパク質が大きい場合、転写時間が長くなる可能性があります。
⑦ ウェット転写は幅広いサイズのタンパク質を転写可能通常のセミドライ転写は30～120KDサイズのタンパク質の転写に適していますが、一部の専用セミドライ転写ではウェット転写と同様にあらゆるサイズのタンパク質を転写できます。これは特定のマシンによって異なります。
⑧ 転写液にも脱イオン水が必要です準備のために、移送タンクと容器を脱イオン水ですすぐ必要があります。タンパク質のサイズに応じて転写液の配合を調整する必要がある、大きなタンパク質（>100 kD）：SDS 1g、メタノール 0 ml、小さなタンパク質（<100kD）：SDS 0g、メタノール 200ml。
⑨ 膜転写のプロセスでは、SDS とメタノールの効果は正反対です。
・SDSをタンパク質と結合させた後、タンパク質をゲルからより容易に転写させることができますが、タンパク質のメンブレンへの結合、特にタンパク質の NC メンブレンへの結合を防ぐこともできます。したがって、大きなタンパク質は転写しにくいため、追加の SDS を追加する必要がありますが、小さなタンパク質は PAGE ゲル内の SDS によって転写できます。過剰な SDS も電流に影響を与え、熱を増加させるため、一部のタンパク質の抗原性に影響を与えます。したがって、状況に応じてSDSの内容をコントロールする必要があります。
・メタノールはSDSとタンパク質の結合を破壊し、タンパク質と膜の結合を促進する可能性がありますが、PAGEゲルの孔径を小さくし、一部のタンパク質の沈殿を引き起こし、実験結果に影響を与えるため、その量は厳密に制御する必要があります。
4. 抗体ハイブリダイゼーション
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1> ブロッキング:
5%脱脂牛奶または5% BSA(TBSTで溶解) をブロッキング溶液として使用します。ブロッキング条件:室温 1h，或 4℃过夜。(標的タンパク質がメンブレンに転写された後、メンブレン上には他の多くのタンパク質が存在します。タンパク質全体がゲルの泳動に使用されるため、他の非標的タンパク質もメンブレンに転写され、多くの抗体が露出します。 )
◆ BSA :牛乳にはタンパク質のリン酸化修飾の状態を変化させるホスファターゼが豊富に含まれているため、一般にタンパク質のリン酸化修飾の検出に使用されます。
◆ ブロッキング溶液の配合やブロッキング条件も変更する必要がある場合があり、特に大きなタンパク質の場合、5% スキムミルクでは 1 時間ブロッキングするには十分ではありません。一部のタンパク質は牛乳や BSA と一緒に使用できない場合があります。ゼラチンを使用すると、ブロックするか、ブロックせずに抗体を直接適用します。 -
2> 一次抗体のインキュベーション:一次抗体をブロッキング溶液で希釈し、4°C で一晩、または室温または 37°C で 1 ～ 1 時間希釈します。
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3>室温、TBST でメンブレンを 5 分間× 4 回洗浄します。
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4> 二次抗体のインキュベーション: 室温で 1 時間。
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5>室温、TBST でメンブレンを 5 分間× 8 ～ 12 回洗浄します。
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6> ECL発色、X線フィルムプレスまたはフィルムスキャン。
-
TBS公式：
1L TBS加える1ml Tween 20だけTBST。
Tween 20：抗原をリフォールディングする機能を有する非イオン性界面活性剤で、抗体の特異的認識能力を向上させ、ブロッキング効果を向上させ、不活性タンパク質または非イオン性界面活性剤で膜上の未結合部位をブロックし、抗体は非特異的に結合するため、タンパク質を乳化する際にタンパク質の構造を破壊しません。
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推奨試薬:
Dickson、.TBS（粉末1包500mL入り）
GE、Amersham ECL Prime Western Blotting Detection Regent (RPN2232)は効果的ですが高価であり、Biyuntianの方がコストパフォーマンスが高いです。
Thermo、SuperSignal West Pico 化学発光基板 (34080)。
5. 画像解析
- Gel-Pro Analyzer またはImageJ を使用する(推奨)
- 参考：
臨床医のための基礎科学研究 - 13. WB結果処理（必読）
【実験技術学習メモ】ウェスタンブロットバンド解析｜Image JとGraphpadのバンドグレースケール解析と処理プロセス
ウェスタンブロット体験の棚卸しはこちら 1件の記事はこちらプロ仕様の Gel-Pro を使用して電気泳動画像を測定するのに十分です
6. よくある問題の分析
1) 非特異的なバンド:
- 抗体濃度が高すぎる場合: ◆ 抗体濃度を下げます。
- 不十分なブロッキング:
◆ ブロッキング溶液の濃度を増やす (例: 5% から 7% に)
◆ ブロッキング時間および/または温度を増やす
◆ ブロッキング緩衝液に 0.05% Tween 20 を添加する
◆ 抗体の希釈に同じブロッキング溶液を使用する - SDS は、抗体とタンパク質バンドの非特異的結合を引き起こします。
◆ 転写後、ブロットを洗浄します。
◆免疫測定中に SDS を使用しないでください。 - 抗体の品質: さまざまな抗体を試してください
2) バンディングが弱い、またはバンディングがない
- 抗体の問題、低活性または低濃度、低親和性一次抗体、不一致の一次抗体と二次抗体:
◆ 抗体濃度を増やす
◆ 抗体が活性を失っている可能性があるため、ドットブロットを実行して活性と最適濃度を決定する
◆ 検査が異なる 抗体および/または一次抗体-二次組み合わせ - 不十分な抗原抗体反応性:
◆ ゲル内のサンプルあたりの総タンパク質負荷量を増加します
。 ◆ タンパク質が分解されていないことを確認するためにサンプルの完全性をチェックします。 - ブロッキング溶液によって抗原がブロックされる
◆ 別のブロッキング溶液を試してみる (例: リン酸化タンパク質を検出する場合は牛乳を避ける)
◆ ブロッキング溶液の濃度を最適化する。3 ～ 5% BSA または脱脂粉乳が推奨される - 化学発光基質の性能が低い
◆ 基質のインキュベーション時間を長くする
◆ 少量の作業溶液を調製して、基質が活性を失っているかどうかを確認します。暗い部屋で、少量の HPR コンジュゲートを基質作業溶液に加えると、青色の光が現れるはずです。そうでない場合は、基質または HRP コンジュゲートが不活性である必要があります。
◆ 基質キット内の 2 つのボトル間に相互汚染がないことを確認してください。2 つの試薬間で相互汚染が発生すると、試薬の活性が低下します。
◆ アジドは HRP の阻害剤です。二次抗体バッファーにはアジドを使用しないでください。 - ブロット上の抗体除去と再ハイブリダイゼーション
抗体除去条件を最適化する
必要な場合にのみ再ハイブリダイゼーション検出を実行する
同じブロットの繰り返しの再ハイブリダイゼーションを回避する - 転写が不十分
◆ 転写時間が短すぎる ウェット転写の場合は転写時間を長くする必要がある ◆
転写電界が弱すぎる 転写電圧または電流を大きくする
◆ 転写液が最適化されていない 追加0.01 ～ 0.05% SDS
◆ トランスファーバッファー中のメタノール濃度を 5% 以下に下げます。
◆ ゲルの選択が適切ではありません。より低い割合のポリアクリルアミドゲルを使用してください。
◆ ポンソーレッド染色液を使用してメンブレンを染色し、クマシーブリリアントブルー染色液を使用して転写後のゲルを染色し、転写効率を確認し、これに基づいて転写を最適化します。膜の状態。 - 転写済み
◆ 転写時間が長すぎます。時間を短縮してください
。 ◆ 転写電界が強すぎます。転写電圧または電流を下げてください
。 ◆ 転写溶液が最適化されていません。「サンドイッチ」を組み立てる前に、転写溶液中でゲルを 20 分間平衡化して、時間を増やしてください。低分子量タンパク質の過剰な移動を避けるために、ゲル中の SDS の濃度を調整します。
◆ トランスファーバッファー中のメタノール濃度を 40% に上げます。
◆ 不適切なゲルの選択、より高いパーセンテージのアクリルアミドゲルを使用します
。 ◆ ターゲットタンパク質の分子量が 10 KD 未満の場合は、トリス/トリシンゲルを使用します。小さなタンパク質の過剰転写を解決するには、0.2 μm メンブレンを使用します。
◆ 小さなタンパク質は大きな孔のブロッティングメンブレンを通過し、0.45 μm メンブレンに 0.2 μm メンブレンを重ねて小さなタンパク質の過剰な移動を検出します。
3) 信号が過飽和している
- 中空のバンド:
◆ ローディング量が多すぎるため、サンプルあたりの総タンパク質ローディング量が減少します。
◆ 抗体が多すぎるため、一次抗体および/または二次抗体の濃度が減少します。
◆ 化学発光基質の感度が高すぎるため、感度の低い化学物質と交換してください。 発光基質 - バンドが密集しているため、バンドがくっつきます。
◆ サンプルのロード量が多すぎるため、サンプルあたりの総タンパク質ロード量が減少します
。 ◆ 抗体が多すぎるため、一次抗体および/または二次抗体の濃度が減少します。
4) ストリップ上の気泡:
- 不適切なサンドイッチアセンブリ
◆ 「サンドイッチ」を組み立てるときに、より多くのトランスファーバッファーを使用します。
◆ 「サンドイッチ」を組み立てるときに、ゲルとメンブレンの間の気泡をすべて取り除きます。 ◆
抗体のインキュベーション前にポンソーを使用します。 メンブレンを色素溶液で染色して、膜の品質を確認します。転写膜。
5) フィルム転写ムラ：
- ブロットの部分的な乾燥または不均一な水和
ブロット全体が均一に浸漬され、トランスファーバッファーに平衡化されていることを確認してください。
PVDF メンブレンは、バッファーに入れる前に 100% メタノールであらかじめ湿らせて平衡化する必要があります。 - ハードウェアの問題
◆ ウェット搬送ユニットの配線接続を確認してください。
◆ 金属プレートが清潔で、物理的な損傷がないことを確認してください。金属プレートがわずかに曲がっているだけでも、セミドライ搬送システムの電界強度が大幅に変化する可能性があります
。フィルム装置の分野は技術的な内容なので、フィルム転写装置を購入する費用が節約できません）
6) 背景が強すぎる:
- 一次抗体および/または二次抗体の濃度が高すぎる: 一次抗体および/または二次抗体の濃度を希釈します。
- 不十分なブロッキング
◆ ブロッキング緩衝液の濃度を上げる（例: 3 ～ 5% ウシ血清アルブミン、カゼイン、スキムミルク）
◆ ブロッキング時間および/または温度を下げる
◆ ブロッキング緩衝液に 0.05% Tween-20 を添加する
◆ 同じ抗体希釈液を使用する ブロッキング溶液（0.05% を添加する）トゥイーン 20) - 間違ったブロッキング溶液が使用されています。一次抗体および/または二次抗体がブロッキングバッファー内のタンパク質に結合しています。別のブロッキング溶液 (アルブミン、カゼイン、スキムミルクなど) を試してください。アビジン-ビオチン システムを使用する場合は、ブロットをブロックするために牛乳を使用しないでください。牛乳にはビオチンが含まれています。
- 洗浄が不十分です。
◆ 洗浄回数とバッファー量を増やします (最低 5 × 5 分)。
◆ 洗浄バッファーに含まれていない場合は、 - 露光時間が長すぎる: イメージング露光時間を短縮してください
- ブロット中にブロットが乾燥する
ブロットが濡れたままであることを確認してください
ブロットが乾燥しないように十分な液体で覆われていることを確認してください - バッファーの再利用は汚染につながります: 新しいバッファーを使用してください
7) 背景がにじむ
- ブロットの一部が乾燥する
ブロットが濡れたままであることを確認してください
ブロットが乾燥しないように十分な液体で覆われていることを確認してください - 一部のブロット領域との洗浄バッファーの接触が不十分です。
洗浄バッファーの量を増やします
。 1 つのインキュベーション容器内にあまりにも多くのブロットを積み重ねないようにしてください。 - 洗浄バッファーと一部のブロット領域の接触が不十分です。きれいなまたは新しい転写「サンドイッチ」を使用してください。
- ブロットの汚れ
◆ ブロットには直接手で触れないでください。常にクリーニング手袋を着用するか、医療用ピンセットを使用してください
。電気泳動装置、転写装置、およびインキュベーションプレートが清潔で、外部の汚染源から離れていることを確認してください。
8) 背景がまだらになる
- ゲルの破片がブロッティングメンブレンに付着する：ブロッティングメンブレンの表面に残ったアクリルアミドゲルの破片を除去します。
- 凝集したブロッキング剤がブロットに付着する
◆ 使用前にブロッキング剤が完全に溶解していることを確認してください
◆ ブロッキング緩衝液に 0.1% Tween-20 を添加します - 抗体の凝集
◆ 抗体緩衝液のろ過には 0.2 μm フィルターを使用します
◆ 新しい抗体を使用します
◆ 抗体緩衝液に 0.1% Tween-20 を添加します - バッファーの汚れ
◆ 新しいバッファーを使用してください
◆ バッファーを 0.2 μm フィルターでフィルターします
9) 内部標準タンパク質の含有量がサンプル間で一致しない
- 実験中に、内部参照として選択されたハウスキーピング タンパク質の発現レベルが変化します
。選択された内部参照タンパク質の実験条件下での一貫性を同定および検証します。つまり、現在の実験条件では内部参照タンパク質の発現レベルが変化しないことを意味します。参照タンパク質 色素を使用して
メンブレン上の総タンパク質を染色し、メンブレン上で検出された総タンパク質を内部標準として使用しました。
10) 内部標準タンパク質検出信号の飽和
- 実験中に、内部標準として選択されたハウスキーピングタンパク質の発現レベルが変化します。
◆ サンプル量を減らしてシグナルの飽和を排除します。
◆ 抗体濃度を希釈するか、インキュベーション時間を短縮して、検出シグナルの飽和を回避します。
◆ 一貫性のある別の低存在量タンパク質を選択します。内部標準としての発現 メンブレン
上の総タンパク質を色素で染色し、メンブレン上で検出された総タンパク質を内部標準として使用します。