一般的なプロセス：
1.研究したい遺伝子に応じてsgRNA（chopchopまたはcrispr.mit）を設計し、既存のベクターに応じて適切なCas9タイプを選択します。
2. sgRNAを合成した後、それをsgRNA発現ベクターに接続します。通常、効率をテストするために2〜3を選択できます。
3.サイト関連の情報に従って、sgRNAカットで長さが約40bpの相同組換えアーム配列（プライマー合成用）を選択します。これには、左側と右側の両方が必要です。
4.研究室にある既存の細胞ベクターによると、neoタグとpuroタグが付いたベクターを見つけ、配列を見つけ、これら2つの抗生物質タグフラグメントを増幅するためのプライマーを設計します。
5.同社は、相同組換えアームを備えた抗生物質増幅フラグメントを合成し、ステップ4のフラグメントをテンプレートとして使用して、相同組換えアームを備えたタグフラグメントを増幅します。
6. Cas9プラスミド、sgRNAプラスミドおよび2つのタグフラグメントをコトランスフェクトし、48時間後、薬物スクリーニング、neoによる薬物スクリーニングの最初のラウンド、スクリーニングの5日後、二重抗体スクリーニングのためにプロを追加し、neoとの両方を削除して選択しますプロ耐性遺伝子ノックアウト細胞;
7.得られた細胞のモノクローナル同定を行い、研究したい遺伝子座で二対立遺伝子編集を行っている細胞株を選択します。
実験時間全体が十分に幸運であれば、1か月半で圧縮できます。CRISPRは非常に一般的なテクノロジーです。恐れずに、考えて実行すれば報酬を得ることができます。
クラシックケース：
2013年1月、米国の2つの研究所が、CRISPR-Cas9テクノロジーに基づく細胞株の遺伝子ノックアウトの新しい方法をScience誌に発表しました。このテクノロジーは、ターゲット固有のRNAを使用するという点で以前のテクノロジーとは異なり、Cas9ヌクレアーゼを特定のものにします。ゲノムを標的とし、それによって特定の遺伝子部位を切断し、突然変異を引き起こします。この技術は、遺伝子ノックアウトマウスやラット動物モデルの構築にすぐに適用されました。一連の研究を通じて、RNA注入によるマウス受精卵へのCRISPR-Casシステムの導入は、DNA注入よりも胚の部位特異的変異の生成に効果的であることが最初に証明されました。これに基づいて、この方法はマウスの遺伝子株に制限がなく、ゲノムDNAの大きな断片を削除できることが発見されました。また、異なる遺伝子を標的とするRNA配列を同時に注入することにより、同じマウスまたはラットで生成することもできます。複数の遺伝子変異。さらに、CRISPR-Cas技術を使用して構築された遺伝子ノックアウトラットモデルは、従来の方法で構築された同じ遺伝子（肥満関連Gタンパク質共役受容体Mc4R）変異ラットと比較して一貫した表現型を持っていることも証明しました。この方法で構築された遺伝子変異動物は、従来の方法よりも生殖細胞系列の伝達能力が大幅に高く、ノックアウト動物モデルを構築するための信頼性が高く、効率的で迅速な新しい方法です。
CRISPR-Casテクノロジーは、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ZFN）、ES細胞ターゲティング、およびTALENに続く、遺伝子ノックアウト大型およびマウス動物の部位特異的構築に使用できる4番目の方法です。これは、非常に効率的で、高速で、生殖細胞系です。強力な伝達能力と単純な経済性の特徴は、動物モデルの構築において非常に幅広い応用の見通しを持っています。
CRISPR / Cas9に必要な材料
1）プラスミド：pSpCas9（BB）-2A-GFP（AddgeneプラスミドID：48138）、cas9のトランスフェクションに使用、このプラスミドにはCas9とGFPが含まれ、Cas9のニッカーゼ活性は特定の標的遺伝子であるGFPのkoに使用されますトランスフェクションラベルとして使用できます。pSpCas9（BB）（AddgeneプラスミドID：42230）、実験で使用したsgRNAがPCR増幅の精製産物である場合、プラスミドはU6のテンプレートとして使用する必要があります。pUC19（Invitrogen、cat.no.15364-011）を使用してsgRNAを構築できます。PCR産物をトランスフェクションに使用する場合、プラスミドはコトランスフェクションに必要であり、DNAキャリアとして機能します。上記の3つのプラスミドについて、sgRNA発現モード（PCR産物/シングルベクターシステム/デュアルベクターシステム）を実験に応じて選択し、どちらを使用するかを決定します。
2）超純水、DNase / RNaseフリー（Life Technologies、カタログ番号10977-023）
3）忠実度の高いポリメラーゼ、Kapa HiFi（Kapa Biosystems）、PfuUltra（Agilen）、Herculase II融合ポリメラーゼは、忠実度の効果が良好である限り、増幅プロセスで変異が生じない限り使用できます。
4）一般的な検出には標準のTaqバッファー（NEB、カタログ番号M0273S）を含むTaqDNAポリメラーゼを使用します。
5）QIAquickゲル抽出キット（Qiagen、カタログ番号28704）
6）QIAprepスピンミニプレップキット（Qiagen、カタログ番号27106）
7）Fast Digest BbsI（BpiI）（Fermentas / Thermo Scientific、カタログ番号FD1014）、sgRNAをpSpCas9（BB）-2A-GFPプラスミドに構築する必要がある場合は、この酵素が必要です。
8）2×ラピッドライゲーションバッファーを含むT7 DNAリガーゼ（Enzymatics、カタログ番号L602L）またはT4 DNAリガーゼ、2つの間に違いはありません。
9）Stbl3の化学的にコンピテントな大腸菌（Life Technologies、カタログ番号C7373-03）
10）dNTP溶液ミックス、各25 mM（Enzymatics、カタログ番号N205L）
11）MgCl2、25 mM（Thermo Scientific、カタログ番号R0971）
12）T4ポリヌクレオチドキナーゼ（New England BioLabs、カタログ番号M0201S）
13）プラスミドセーフATP依存性DNase（Epicentre、カタログ番号E3101K）
14）アデノシン5'-三リン酸、10 mM（New England BioLabs、カタログ番号P0756S）
15）SOC培地（ニューイングランドバイオラボ、カタログ番号B9020S）
CRISPR / Cas9操作プロセス
1）ターゲットサイトを決定します。CRISPRオンラインデザインツールhttp://crispr.mit.edu/に従ってsgRNAをデザインします（他のデザインツールもありますが、このソフトウェアをお勧めします）。イントロンを避けるために標的遺伝子の250bp以内にヌクレオチド配列を入力すると、候補標的部位が約10分で与えられます。または手動選択標的領域の5'-NGG（PAM）上流の20bpフラグメントを標的部位として使用できます。一般に、標的部位はセンス鎖またはアンチセンス鎖のいずれかで選択できます。
2）sgRNA発現システムを準備します。3つのオプションが利用可能です：
a。PCRを直接使用して精製産物を増幅します。産物フラグメントには、約370bpのU6 + sgRNAが含まれています。
b。sgRNAベクターをpSpCas9（BB）-2A-GFPpUC19プラスミドに構築します。これは単一のベクターシステムです。
c、sgRNAベクターは構造に構築されます
3）pUC19に組み込まれ、デュアルベクトルシステムになります。
a。sgRNA発現構造のPCR増幅。
PCRシステムは次のとおりです。
PCR反応条件は以下のとおりです。手順は固定されており、変更することはお勧めしません。
PCR後、2％アガロースゲル電気泳動、5ul PCR産物、15 V cm-1、30分で確認しました。バンド位置は370bpです。
PCR産物は、キットの説明書に従ってQIAquick PCR精製キットで精製し、最後に35ulEBバッファーまたは水を使用して回収します。
b。sgRNAベクター-シングルベクターシステム（pSpCas9（BB）-2A-GFP）の構築。まず、前述の方法で標的部位を決定し、標的部位に応じて挿入するsgRNAオリゴを設計します。
一般的に、sgRNAオリゴの形態は次のとおりです。
sgRNA上：CACCgNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN sgRNA下：AAACNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNc 2つの設計されたオリゴをリン酸化し、アニーリングして二本鎖にする必要があります。システムは次のとおりです。毎分25°Cまで。終了後、水で1：200（1ulオリゴ+199 H2O）で希釈します。次に、合成したsgRNAオリゴをターゲットベクターに挿入します。この実験では、pSpCas9（BB）-2A-GFPを使用します。ライゲーション反応系は以下の通りです。その中で、pSpCas9（BB）-2A-GFP 100ngは、濃度に応じて容量を調整します。
1時間接続します。コントロールを設計します。コントロールは上記と同じですが、オリゴは追加されていません。
ライゲーション反応の条件は次のとおりです。ライゲーション反応が完了したら、PlasmidSafeエキソヌクレアーゼを使用して線状DNA残基を除去することをお勧めします。このステップはオプションですが、強くお勧めします。37°C30分、70°C30分 その後、-20℃で1週間以上保存できます。
このステップの後の製品は、E。coliの形質転換に直接使用でき、Stbl3コンピテントが推奨されます。ヒートショック法を採用：2ulのPlasmidSafeプラスミドを20ulのコンピテントに加え、氷上に10分間置き、42°C、30秒間熱ショックを与え、すぐに氷上に2分間置き、100ulのSOCを加え、プレートを直接コーティングします。 。Amp100を含むLBプレートを使用しました。37℃で一晩。翌日の観察では、コントロールプレートにはクローンがないはずですが、sgRNAインサートを含むプレートにはクローンがあるはずです。モノクローナルシェイクバクテリアを選び、プラスミド抽出にQIAprepスピンミニプレップキットを使用します。シーケンス用のシーケンスプライマーとしてU6-Fwdプライマーを使用します。
c。sgRNAデュアルベクター発現システム（pUC19に構築）pUC19を使用してデュアルベクター発現システムを確立する場合は、まず前の方法を参照して標的部位を見つけ、U6 + sgRNAscaffordを増幅するプライマーを設計します。FwdプライマーEcoRI、Revを含む必要がありますプライマーはHindIII制限部位を含む必要があります。次に、制限消化や接続などの操作を実行します。消化システムは次のとおりです。U6+ sgRNA PCR産物の消化pUC19プラスミド消化産物の精製、QIAQuick PCR精製キットを使用、精製後は-20°Cで保存できます。ライゲーション：消化したプラスミドとPCR産物を1：3の比率で室温で15分間接続します。ライゲーション反応が完了したら、PlasmidSafeエキソヌクレアーゼを使用して線状DNA残基を除去することをお勧めします。（オプション）その後の大腸菌の形質転換、熱ショック形質転換、プレートコーティング、単一コロニーの選択、細菌の振とう、プラスミド抽出、および配列決定の検出。
もちろん、ご不明な点がございましたら、2021年3月2日の次の生放送でご相談ください！
