[R Language]——Gene GO/KEGG enrichment analysis! Super simple nanny-level tutorial!

In the previous issue, " Dry information warning - it turns out that gene function enrichment analysis is so simple! " and " [R language] - Visualization of gene GO/KEGG functional enrichment results (nanny-level tutorial) " introduced how to use the DAVID online analysis tool to perform GO on genes /KEGG functional enrichment analysis and use the R ggplot package to visualize the obtained gene GO/KEGG functional enrichment results. This issue introduces the use of R clusterProfiler package and R AnnotationHub package to perform GO/KEGG functional enrichment analysis of genes, OrgDb package production, and result visualization.

The most important thing in GO/KEGG functional enrichment analysis is the selection of background genes. To enrich genes using the R clusterProfiler package, you need to import the reference genome (background gene) of the species corresponding to the target gene (foreground gene). At this stage, "bioconductor" There are already OrgDbs for more than a dozen common animals, such as humans, mice and other species. However, there are still many species that are not in Bioconductor's OrgDb list, but have reference genomes, such as goats, sheep, etc. In this case, you need to use the R AnnotationHub package to index the reference genome of the corresponding species and create an OrgDb package for use.

1 Data preparation

Data input format (xlsx format):

2 R package loading, data import and processing

#下载包#
if(!requireNamespace("BiocManager", quietly = TRUE))
  install.packages("BiocManager")
BiocManager::install("clusterProfiler") 
BiocManager::install("topGO") 
BiocManager::install("Rgraphviz") 
BiocManager::install("pathview") 
install.packages("ggplot2")
BiocManager::install('stringr')
install.packages("openxlsx")
#加载包#
library(clusterProfiler)
library(topGO)
library(Rgraphviz)
library(pathview)
library(ggplot2)
library(stringr)
library(openxlsx)
 
#导入数据#
remove(list = ls()) #清除 Global Environment
getwd()  #查看当前工作路径
setwd("C:/Rdata/jc")  #设置需要的工作路径
list.files()  #查看当前工作目录下的文件
data = read.xlsx("enrich-gene.xlsx",sheet= "enrich_genes",sep=',') #导入数据
head(data)

#数据处理-差异基因筛选#
vector = abs(data$log2FC) > 1 & data$PValue < 0.05 & data$gene_name !="" ##abs绝对值;通常logFC> 1和PValue< 0.05条件进行筛选；data$gene_name != ""表示gene_name不为空白
#data$gene_name<-str_to_title(data$gene_name)#用stringr将基因名称的第一个字母大写（小鼠首字母为大写）
data_sgni= data[vector,]#筛选差异基因
head(data_sgni)
#All_gene <- rownames(data) # 提取所有基因基因名

3 Background gene selection and GO/KEGG enrichment analysis

3.1 Enrichment analysis of species with OrgDb in “bioconductor”

Find the OrgDb of the required species in http://bioconductor.org/packages/release/BiocViews.html#___OrgDb (currently only the species shown in the picture below), take human "org.Hs.eg.db" as an example:

Figure 1 Species that already have OrgDb in “bioconductor”

#已有OrgDb的常见物种#
BiocManager::install("org.Hs.eg.db") 
library(org.Hs.eg.db)
#基因ID转换#
keytypes(org.Hs.eg.db) #查看所有可转化类型
entrezid_all = mapIds(x = org.Hs.eg.db,  #id转换的比对基因组（背景基因）的物种，以人为例
                      keys = data_sgni$gene_name, #将输入的gene_name列进行数据转换
                      keytype = "SYMBOL", #输入数据的类型
                      column = "ENTREZID")#输出数据的类型
entrezid_all  = na.omit(entrezid_all)  #na省略entrezid_all中不是一一对应的数据情况
entrezid_all = data.frame(entrezid_all) #将entrezid_all变成数据框格式
head(entrezid_all)

###GO富集分析###
GO_enrich = enrichGO(gene = entrezid_all[,1], #表示前景基因，即待富集的基因列表;[,1]表示对entrezid_all数据集的第1列进行处理
                     OrgDb = org.Hs.eg.db, 
                     keyType = "ENTREZID", #输入数据的类型
                     ont = "ALL", #可以输入CC/MF/BP/ALL
                     #universe = 背景数据集 # 表示背景基因，无参的物种选择组装出来的全部unigenes作为背景基因；有参背景基因则不需要。
                     pvalueCutoff = 1,qvalueCutoff = 1, #表示筛选的阈值，阈值设置太严格可导致筛选不到基因。可指定 1 以输出全部
                     readable = T) #是否将基因ID映射到基因名称。
GO_enrich  = data.frame(GO_enrich) #将GO_enrich导成数据框格式
#数据导出#
write.csv(GO_enrich,'C:/Rdata/保存文件/GO_enrich.csv') 

###KEGG富集分析###
KEGG_enrich = enrichKEGG(gene = entrezid_all[,1], #即待富集的基因列表
                         keyType = "kegg",
                         pAdjustMethod = 'fdr',  #指定p值校正方法
                         organism= "human",  #hsa，可根据你自己要研究的物种更改，可在https://www.kegg.jp/brite/br08611中寻找
                         qvalueCutoff = 1, #指定 p 值阈值（可指定 1 以输出全部）
                         pvalueCutoff=1) #指定 q 值阈值（可指定 1 以输出全部）
KEGG_enrich  = data.frame(KEGG_enrich)
write.csv(KEGG_enrich,'C:/Rdata/保存文件/KEGG_enrich.csv') #数据导出

3.2 Use "AnnotationHub" to obtain online annotations and create OrgDb objects

如果你所研究的物种不在Bioconductor的OrgDb列表里，但存在参考基因组，如山羊(Capra hircus/goat/chx)，绵羊(sheet/Ovis aries)等，这种情况则需要用到AnnotationHub函数进行索引其对应物种的参考基因组（背景基因），并制作OrgDb包使用。

注意：AnnotationHub包连接的Bioconductor数据库是实时更新的，所以需要用到的时候再在线查询和使用。

###制作可索引到物种的OrgDb包###
#下载和加载包#
BiocManager::install("AnnotationHub") 
BiocManager::install("AnnotationDbi")
BiocManager::install("rtracklayer")
library(AnnotationHub)
library(AnnotationDbi)
library(rtracklayer)
#索引与制作OrgDb#
hub <- AnnotationHub() #建立AnnotationHub对象保存到hub
query(hub, 'Capra hircus')  #查询包含山羊(Capra hircus)的物种信息;结果有物种的各类信息需要进一步筛选
query(hub[hub$rdataclass == "OrgDb"] , "Capra hircus") #筛选我们需要OrgDb类型；也可将上一步与这一步合并成query(hub,'org.Capra hircus')进行搜索
goat <- hub[['AH101444']]  #制作Capra hircus的OrgDb库；AH101444是Capra hircus对应的编号。
goat　#查看goat
#help('select') 

#保存、载入与查看-AnnotationDbi#
saveDb(goat,file="goat.OrgDb") #把goat对象保存成goat.OrgDb文件
goat = loadDb(file="goat.OrgDb") #载入goat.OrgDb文件，保存到goat
length(keys(goat)) #查看包含的基因数量
columns(goat) #查看goat的数据类型
keys(goat, keytype = "SYMBOL") #查看SYMBOL数据集下的ID

# 查看AnnotationHub内容——根据自己兴趣了解#
#display(hub) #调出网页
#unique(hub$species) #查看hub里包含的所有物种
#unique(hub$rdataclass) #查看hub里的数据类型
#hub[hub$rdataclass == "OrgDb"] #查看hub里OrgDb类型的数据

#基因ID转换#
keytypes(goat) #查看所有可转化类型
entrezid_all = mapIds(x = goat,  #id转换的比对基因组（背景基因）所属物种，这边为山羊
                      keys = data_sgni$gene_name, #将输入的gene_name列进行数据转换
                      keytype = "SYMBOL", #输入数据的类型
                      column = "ENTREZID")#输出数据的类型
entrezid_all = na.omit(entrezid_all)  #na省略entrezid_all中不是一一对应的数据情况
entrezid_all = data.frame(entrezid_all) #将entrezid_all变成数据框格式
head(entrezid_all)
#GO富集分析#
GO_enrich = enrichGO(gene = entrezid_all[,1],  #待富集的基因列表
                      OrgDb = goat,  #指定物种的基因数据库，goat直接赋值给OrgDb参数即可
                      keyType = 'ENTREZID',  #输入数据的类型
                      ont = 'ALL',  #可指定 BP\MF\CC\ALL 
                      pAdjustMethod = 'fdr',  #指定 p 值校正方法
                      pvalueCutoff = 1,  #指定 p 值阈值（指定 1 以输出全部）
                      qvalueCutoff = 1,  #指定 q 值阈值（指定 1 以输出全部）
                      readable = FALSE)
GO_enrich = data.frame(GO_enrich)
write.csv(GO_enrich,'C:/Rdata/保存文件/GO_enrich.csv') #数据导出#
###KEGG富集分析###
KEGG_enrich = enrichKEGG(gene = entrezid_all[,1], #即待富集的基因列表
                         keyType = "kegg",
                         pAdjustMethod = 'fdr',  #指定p值校正方法
                         organism= "chx",  #山羊，可根据你自己要研究的物种更改，可在https://www.kegg.jp/brite/br08611中寻找
                         qvalueCutoff = 1, #指定 p 值阈值（可指定 1 以输出全部）
                         pvalueCutoff=1) #指定 q 值阈值（可指定 1 以输出全部）
KEGG_enrich  = data.frame(KEGG_enrich)
write.csv(KEGG_enrich,'C:/Rdata/保存文件/KEGG_enrich.csv') #数据导出

输出的GO/KEGG富集结果各列内容：

ONTOLOGY：GO的BP（生物学过程）、CC（细胞组分）或MF（分子功能）三个方面内容；

ID：富集到的GO term/KEGG term；

Description：对GO term/KEGG term的生物学功能和意义进行描述；

GeneRatio：富集到该GO term/KEGG term中的基因数目/给定基因的总数目；

BgRatio：该GO term/KEGG term中背景基因总数目/该物种所有已知GO功能基因的数目；

pvalue、p.adjust和qvalue：p值、校正后p值和q值；

geneID和Count：富集到该GO term/KEGG term中的基因名称和数目。

4 GO/KEGG富集结果可视化

###GO/KEGG富集结果可视化###
#数据载入与处理#
install.packages("ggplot2")
library(ggplot2)
go_enrich = read.xlsx("enrich-gene.xlsx",sheet= "ONTOLOGY",sep=',')  
go_enrich$term <- paste(go_enrich$ID, go_enrich$Description, sep = ': ') #将ID与Description合并成新的一列
go_enrich$term <- factor(go_enrich$term, levels = go_enrich$term,ordered = T)

#纵向柱状图#
ggplot(go_enrich, 
       aes(x=term,y=Count, fill=ONTOLOGY)) + #x、y轴定义；根据ONTOLOGY填充颜色
  geom_bar(stat="identity", width=0.8) +  #柱状图宽度
  scale_fill_manual(values = c("#6666FF", "#33CC33", "#FF6666") ) +  #柱状图填充颜色
  facet_grid(ONTOLOGY~., scale = 'free_y', space = 'free_y')+
  coord_flip() +  #让柱状图变为纵向
  xlab("GO term") +  #x轴标签
  ylab("Gene_Number") +  #y轴标签
  labs(title = "GO Terms Enrich")+  #设置标题
  theme_bw()
#help(theme) #查阅这个函数其他具体格式

#横向柱状图#
ggplot(go_enrich, 
       aes(x=term,y=Count, fill=ONTOLOGY)) +  #x、y轴定义；根据ONTOLOGY填充颜色
  geom_bar(stat="identity", width=0.8) +  #柱状图宽度
  scale_fill_manual(values = c("#6666FF", "#33CC33", "#FF6666") ) + #柱状图填充颜色
  facet_grid(.~ONTOLOGY, scale = 'free_x', space = 'free_x')+
  xlab("GO term") + #x轴标签
  ylab("Gene_Number") +  #y轴标签
  labs(title = "GO Terms Enrich")+ #设置标题
  theme_bw() + 
  theme(axis.text.x=element_text(family="sans",face = "bold", color="gray50",angle = 70,vjust = 1, hjust = 1 )) #对字体样式、颜色、还有横坐标角度（）

#气泡图#
ggplot(go_enrich,
       aes(y=term,x=Count))+
  geom_point(aes(size=Count,color=p.adjust))+
  facet_grid(ONTOLOGY~., scale = 'free_y', space = 'free_y')+
  scale_color_gradient(low = "red",high ="blue")+
  labs(color=expression(PValue,size="Count"), 
       x="Gene Ratio",y="GO term",title="GO Enrichment")+
  theme_bw()

图1 为GO富集结果图

KEGG富集结果与GO富集结果可视化类似可参考上一期“【R语言】——基因GO/KEGG功能富集结果可视化（保姆级教程）”内容。

好了本次分享就到这里，下期有更精彩内容，敬请期待。

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