凝胶电泳回顾

  • 根据DNA marker看条带大小
  • 看条带大小是否与目的条带的大小一致
  • 看根据条带亮度推测DNA量
  • 看PCR引物是否特异,即是否有杂带
  • 看是否有引物二聚体判断引物的好坏

  • DNA凝胶电泳标准琼脂糖浓度一般为1.0%。浓度越高,小条带的分辨率越高;琼脂糖浓度越低,大分子量条带的分辨率和分离程度越高
  • 电场中,中性pH值缓冲液(TAE/TBE)下DNA带净负电荷向凝胶装置正极(+)移动(下图中,上为“-极”至下为“+极”),DNA分子越大所受阻力越大,迁移越慢,500bp的DNA分子比200bp的DNA分子迁移慢。负电荷的磷酸集团。
  • 电泳时需将DNA与荧光染料混匀,结合染料后,DNA在紫外灯下发出荧光,才会出现亮色条带,常用染料有EB(溴化乙啶)、gel red、sybrgreen1等(有钱建议不要用EB,有毒)。溴化乙锭等类似的核酸染料一定控制好用量(注意Gelred或者Gelgreen核酸染料更要控制用量,Gelred由两个溴化乙锭分子拼接,而Gelgreen由两个SYBR Green分子拼接,显色灵敏度或许更高,但嵌入核酸分子中后的阻力也更大),按说明书标准使用,切忌随意。
  • 电泳结果解读,无法直接判断DNA长度,需要在电泳过程将DNA产物与DNA标准品(DNA Marker)一起电泳,DNA Marker里面含有若干种长度已知的DNA(下图中出现6条亮带的就是DNA Marker),与之比较可以粗略判断DNA样品的长度。DNA Marker中的DNA片段浓度已知与DNA Marker的亮度比较初步判断DNA样品浓度
  • 结果解读:与DNA Marker比较,野生型边这个图,DNA片段长度大小约200bp,突变型是右边,突变有纯合突变和杂合突变,500bp的条带即纯合突变,最右200bp及500bp两条条带即为杂合突变。
    在这里插入图片描述

DNA电泳技术分离时影响其迁移速率的因素

  • DNA的分子大小
  • 琼脂糖浓度
  • DNA分子的构象。相同分子量的线状、开环和超螺旋DNA在琼脂糖凝胶中移动速度是不一样的,超螺旋DNA移动最快,而开环双链DNA移动最慢。
  • 电源电压。在低电压时,线状DNA片段的迁移速率与所加电压成正比
  • 嵌入染料的存在。染料会嵌入到堆积的碱基对之间并拉长线状和带缺口的环状DNA,使其刚性更强,使线状DNA迁移率降低15%
  • 离子强度影响。电泳缓冲液的组成及其离子强度影响DNA的电泳迁移率

分子生物学实验:https://max.book118.com/html/2016/0302/36634240.shtm

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転載: blog.csdn.net/geekfocus/article/details/120572181