進化的リシーケンシング（Evolve and Resequence、E＆R ）は、実験室条件下での新しい環境への集団の適応プロセスを研究し、第2世代のシーケンシングテクノロジーを通じて適応プロセス中の遺伝子の変化を分析することです。分子進化過程をゲノムレベルでリアルタイムに監視できます。E＆Rは、RNA 、バクテリア、イースト、フルーツハエの研究に適用されています。彼らの研究は完全に同じではありませんが、これらの違いは、初期集団の数、初期遺伝子変異のレベル、組換え率、適応の範囲などの要因を含む既存の集団遺伝学理論を使用することによって大部分説明できます。
新しい環境への生物の適応は、地球上で比類のない生物多様性をもたらしました。しかし、この適応は分子レベルでどのように起こりますか？このような問題に直面しても、合理的かつ正確な回答をすることは依然として困難です。自然選択の役割と動的プロセスについて推測することは言うまでもなく、種の分化につながる好ましい突然変異部位を特定することは、私たちにとってすでに大きな課題です。順応に関連する多くの問題は、好ましい突然変異の進化の速度、それらの効果の大きさ、それらが互いにどのように相互作用するか、そして環境が対立遺伝子の頻度にどのように影響するかなど、依然として議論の余地があります。
前世紀において、さまざまな分野の生物学者は、実験室での進化を通じて適応のプロセスを研究しようと試みてきました。彼らは、新しい実験室環境への異なる集団の適応が、生物の適応プロセスをよく反映できることを発見しました。ただし、実験的な技術的条件の制限により、これらの研究は表現型のみを対象としており、分子レベルでそれを行うことは困難です。もちろん、シーケンシング技術、特に第2世代のシーケンシング技術の進歩により、人々は適応のプロセスを分子レベルで研究することが可能になります。人々は、 RNA分子、ウイルス、バクテリア、イースト、フルーツハエの進化的リシーケンシング（ E＆R ）研究を次々と実施してきました。E＆R調査を通じて、人々は進化プロセスをリアルタイムで監視できます。この種のリアルタイムモニタリングは、適応プロセスに関するいくつかの質問を理解するのに役立ちます。たとえば、既存の突然変異（立っている遺伝子変異）が適応に大きな役割を果たしているのか、それとも新しい突然変異が大きな役割を果たしているのかなどです。分子レベルでの進化は再現可能ですか？適応の過程で、好ましい変動の自然な選択係数は適応の過程で変化しますか？適応の過程で、タンパク質のコーディングと調節領域の役割は何ですか？待つ。
E＆R研究には4つの研究システムがあります。
・ invitro単一ヌクレオチド研究（ RNAまたはDNA ）
・ 細菌および酵母集団の単クローン集団、
・ ハイブリッド酵母集団に由来し、
• ハイブリッドフルーツフライの個体群に由来します。
これらの4つの研究システムの結果は完全に一貫しているわけではありません。たとえば、in vitro実験では多くの異なる結果が得られます。微生物の無性生殖システムは通常、集団に固定された少数の好ましい突然変異を観察できますが、性生殖システムは通常特性を示します。ポリジェニック。
E＆R ：研究システムの概要
インビトロ研究単一ヌクレオチドシステム：通常、 RNAに転写されたDNAによって短いDNA配列に由来し、次にRNAは選択された異なる化学システムに曝露され、次に転写酵素を拡大および逆転させます。順番に10〜20回サイクルします。これは、分子スクリーニングにも使用できます。インビトロシステムの「ゲノム」は比較的小さいため、サンガーシーケンシングは最後に選択されたRNAドメインを特定できます。
無性に複製されたモノクローナル集団：通常、無性の複製を通じて進化する10 ^ 6-10 ^ 8の細菌または酵母の集団。微生物は急速に成長するため、数週間から数か月以内に数百世代にわたって増殖する可能性があります。一部の人々は、 25回の進化実験、合計6世代以上にわたってE.coliを持っています。対照的に、人間の進化が6世代の場合、 1億2000万年前、つまり1億2000万年が必要になりますが、ホモサピエンスはまだ登場していません。
ハイブリダイゼーションに由来する酵母集団システム：この集団は、大集団などの微生物集団の特徴だけでなく、初期集団における性的繁殖や遺伝的変異などの多くの新しい特徴も持っています。進化的集団全体について、 Pool-seqによってシーケンスを実行して、集団の遺伝子頻度を取得できます。
ハイブリダイゼーションに由来する性的真核生物システム：ドロソフィラはこのシステムの代表であり、最初の集団は野生から来ているため、集団にはまれなバリエーションがたくさんあります。人口サイズは100から1000の範囲である可能性があります。微生物と比較して、限られた数の世代を飛ぶ、通常1〜3年の実験は25〜75世代しか繁殖できない。
選択中のサイトの動的な変更
集団遺伝学理論には、対立遺伝子頻度の変化について多くの予測と説明がありますが、それを裏付ける実際の実験データはほとんどありません。E＆R実験では、さまざまな時点での集団の遺伝子頻度を調べることにより、変化率、変化の大きさなど、適応プロセス中の対立遺伝子頻度の変化を明確に理解できます。
インビトロ実験では、初期対立遺伝子頻度が10 ^ -16の部位は、 10ラウンドの選択後に集団内で固定できます。これは、好ましい突然変異が強い正の選択の対象であり、選択係数が50％を超えることを示しています。、人口の遺伝的多様性は急速に失われ、人口の適応性は急速に増加します。
インビトロ実験システムでは、集団中の半数体のタイプは、進化的選択の過程で急速に減少し、遺伝子ヘテロ接合性も急速に減少します。
モノクローナル集団のバクテリアとフルーツハエの場合、対立遺伝子頻度の変化は複雑になる可能性があります。効果的な遺伝子組換えがないため、突然変異間の干渉効果は非常に明白であり（クローン干渉）、好ましい突然変異は他の半数体上の好ましい突然変異と激しく競合しなければなりません。幸運な人だけが彼らの遺伝子を集団に固定することができます。インビトロ実験と比較して、無性生殖部位の選択圧力は通常非常に良好であり、 1％〜20％であり、これは遺伝子の複数の効果によって制限される可能性がある。
モノクローナル集団では、異なる突然変異部位間の競争は非常に激しく、進化の過程は常に新しくより好ましい突然変異の出現を伴います。各時点で異なる優勢なハプロタイプがあり、集団全体がヘテロ接合です。セックスのレベルは非常に低いです。
無性的に繁殖するハイブリッド酵母集団の場合、初期集団には多数の変異型があり、遺伝的多様性が高いため、選択に対する集団の反応も非常に速い。対立遺伝子頻度の変化に基づいて、選択圧力はわずか約1％であると推定されます。集団内の対立遺伝子の変化は、適応中に遺伝子がどのように再結合されるかを反映している可能性があります。数千kbのシーケンスに有害または有益な遺伝子が含まれている場合、このシーケンスはこのプロセスを通じて明確に識別できます。さらに、ほとんどすべての適応プロセスには、新しい突然変異部位ではなく、既存の遺伝子突然変異の関与が含まれます。
ハイブリッド酵母集団の初期集団には、多数の既存の突然変異タイプが含まれています。中程度に近い選択の影響により、集団内で突然変異タイプの1つの頻度が急速に増加します。無性生殖には遺伝子組換えがないため、このハプロタイプが集団内にあります。それは長期間存在する可能性があり、グループのヘテロ接合性も急速に低下します。
フルーツハエの性的繁殖の場合、開始集団は数百の天然半数体を含むグループですが、性的繁殖と遺伝子組換えの存在により、部位間の干渉効果が進化を妨げる可能性は低いです。2つの異なる遺伝子領域が独立して自然選択に応答できます。ゲノムの特定の領域では、自然な選択によりヘテロ接合性が低下している可能性がありますが、ヘテロ接合性をゼロに低下させることは困難です。これは、新しい変異ではなく既存の変異に基づいて選択が行われることも意味します（ソフト選択スイープ）。
上の画像：適応前後の集団におけるSNPの頻度の変化;中央の画像：進化中の半数体の変化性的複製と遺伝子組換えにより、異なる領域の遺伝子が再結合されて複数を形成している新しい半数体;下の写真：進化の過程で、ヘテロ接合性が変化し、選択した部位の近くのヘテロ接合性が減少し（黒い矢印でマーク）、ヘテロ接合性が赤から緑に変化します
上記のいくつかの実験システムを比較すると、実験対象が異なれば選択に対する反応も大きく異なり、進化の過程にも一定の違いがあることがわかります。
E&R实验中的突变
对于体外实验系统，分子的多样性通常受限于DNA合成平台，比如一个DNA合成平台通常能够产生10^16种分子，而一个60个碱基长度的序列的分子多样性可以达到4^60，这个理论数量要比实际分子数量多20个数量级。所以选择可以发挥作用的空间很大。
对于无性单克隆系统，尽管基因之间的相互干扰会延长基因固定的时间，但是和其他系统相比，它的基因多样性仍然是偏低的。由于其起源群体遗传背景单一，所以群体中的变异类型多是新突变产生的。而且对于每一种新环境，似乎总有很多有利突变。在细菌和酵母的E&R中，发现了很多不同类型的突变。尽管点突变依旧是多数，但是小的插入缺失突变和较大的重复序列及缺失，以及转座子都对新环境的适应发挥了重要作用。很多受选择的突变都涉及到某些功能缺失，比如提前出现的终止密码子、转座子在基因中插入等。似乎选择压力倾向于某些细胞功能的丢失。
在无性繁殖的单克隆酵母群体中，通过E&R实验发现大量重复序列可以用来应对环境压力。通过增加基因拷贝数，能够补偿有害突变的作用或者提升个体对资源有限的外界环境的适应。但是对于杂交的微生物群体，其适应环境主要是在现有变异基础之上发生的，在E&R实验中，并没有观测到大规模的基因结构突变和拷贝数突变。一个可能的解释是，相对于新的突变，现有基因变异在群体中存在了一定的时间，其对群体带来的负面作用比突变要小很多，所以现有基因变异更容易被选择下来。
关于新突变和现有变异哪一个对适应更重要的争论还有没有结束。在对人类基因组的研究中，显示现有变异对适应的意义更大，不过在对果蝇的研究中，却得到了相反的结论，认为新突变对果蝇适应新的环境更有意义。也就是说，对于一个种群数量较大的群体而言，新突变的进化的意义可能比现有变异的意义更大。
目前为止，针对果蝇的E&R的实验还不能精确的识别出是哪一个基因和环境适应有关系，通常只能够识别出数百Kbp的一段序列，该序列中杂合度水平降低，SNP频率改变。此外，果蝇的E&R实验能否识别出适应的发生很大程度上依赖于实验设计，比如实验的重复数、群体数量、经历的世代数等。重复数多、群体大、世代数多能够大大提升对受选择基因的识别能力和在基因组上的定位能力。
平行进化（Parallel evolution）
平行进化是指来自同一个群体的两个分支独立进化，但进化过程和结果很相似。与自然条件下的进化不同，E&R能够精确的控制环境条件，能够同时进行多个重复，因而E&R是研究平行进化的最有效的工具。
对于无性繁殖的单克隆的酵母和细菌群体，进化依赖于新出现的突变，但是突变的随机性导致了在突变水平上，很难观测到平行进化现象；不过在更高一级的基因水平和细胞功能水平，是可以看到平行进化现象的，即某些基因或细胞功能是不同分支群体相同的进化靶标，虽然这些基因或细胞功能内有具体不同的突变情况。比如影响细胞代谢的某些基因，或者影响细胞形状的基因，亦或者某些应对外界环境压力的基因。
对于杂交E&R研究系统，起始群体中已经存在了大量的多态性位点，但是可能只有其中的一小部分是进化选择的靶标。要识别出这些靶标，E&R的设计很关键，即增加实验的重复数量能够很有效的提升识别这些靶标的能力。在果蝇的E&R研究中，平行进化是很常见的。首先因为其实群体有很多相同的变异位点，其中的很多变异位点，可能是不同实验重复共同的作用靶标。其次，由于存在有性生殖和基因重组，因而位点之间的相互干扰很微弱，也就意味着不同的有利位点可以同时且相互独立地提升在群体中的频率。
不过也要注意到，在观察平行进化的同时，重复之间可能存在的基因流可能对观察结果造成影响，虽然这些基因流可能是无意中发生的，但哪怕每一代只有一个个体的基因交换，那么这两个重复之间的中性等位基因频率也会被同质化。
上位效应（Epistasis）
上位效应是指基因之间的相互影响。在体外E&R系统（如体外RNA分子刷选实验）中，上位效应是普遍存在的，而且这种上位效应能够在很短的序列内发生，所以二代测序的一个读长通常就足够来了解不同变异之间的相互影响。不过对于杂交E&R系统（果蝇），观察到基因之间的上位效应很困难。这可能是由于杂交系统的有利变异可以存在于多种单倍体上，而自然选择可以直接作用在这些单倍体上。在杂交E&R系统中，最简单识别上位效应的方法就是识别出非关联位点的连锁不平衡（LD），不过如果是用Pool-seq池测序的方法来测序，只能得到等位基因频率，无法得到不同位点的关联性，所以在方法上，也很难识别出杂交E&R系统的上位效应。
总结
E＆R研究は、 30bpの核酸配列に使用でき、フルーツハエのような多細胞真核生物にも使用できます。進化の原理は同じです。最大の違いは、新しい環境への応答速度と進化の分子基盤にあります。初期集団の特性と自然選択の圧力が、上記の違いの主な理由です。集団における無性生殖、遺伝子間の相互干渉（クローン干渉）は、異なるタイプの競合する半数体、集団における性的生殖を決定し、遺伝子選択間の圧力応答とは比較的独立している可能性があります。既存の突然変異に由来するE＆Rシステム（ハイブリダイゼーションシステム）では、適応のプロセスは比較的確実であり、すべての実験の繰り返しは自然な選択のために同様の突然変異部位を持っていますが、モノクローナル集団の場合、進化は新しいものに基づいています結果として生じる突然変異、したがって進化プロセスは不確実性とランダム性に満ちています。
最後に、 E＆R研究は自然選択プロセスの実験室シミュレーションに基づいていますが、それは私たちの研究に大きな利便性をもたらしました。しかし、実験室シミュレーションと実際の自然選択プロセスの間にはまだ一定の違いがあることを確認する必要があります。
=====終わり====
文書来源：Long、A.、Liti、G.、Luptak、A。、＆Tenaillon、O。（2015）進化と再配列実験による適応の分子構造の解明。 Nature Reviews Genetics 、 16 （10）、567。
