La última vez, el editor introdujo principalmente microorganismos y contaminantes comunes en muestras con baja biomasa, como la cavidad oral y la vagina, pero la alta sensibilidad de la tecnología de secuenciación también amplifica el impacto de la contaminación del ADN en las muestras. baja biomasa Es muy importante~
En 2019, en el documento "Contaminación en estudios de microbioma de biomasa microbiana baja: problemas y recomendaciones" [1], se propuso por primera vez la teoría del control de la contaminación para muestras de biomasa baja, principalmente el proceso detallado de tratamiento de contaminación de muestras de biomasa baja, que simplifica el proceso de contaminación El método de procesamiento se describe en detalle a continuación:
01
Diseño Experimental para la Reducción de la Contaminación:
El ADN de las muestras se extrae en un entorno de sala limpia utilizando kits y reactivos ultralimpios, y los experimentos previos y posteriores a la PCR se realizan en áreas designadas separadas.
02
Controle el ADN contaminante:
Registre muestras de control negativo, como: diferentes países, diferentes hospitales, diferentes tipos de muestras, fuentes de lotes (origen de dirección, lote de extracción de ADN, lote de amplificación de PCR y número de biblioteca de secuenciación). La incorporación de controles negativos en cada tipo de lote permite la detección de diferentes tipos de efectos de lote.
Al mismo tiempo, se propone la lista de verificación RIDE para proporcionar a los investigadores una lista de verificación estándar mínima para la investigación de microbiomas en muestras de baja biomasa microbiana.
Esta lista de verificación consta de cuatro partes:
01
Informar sobre diseños y métodos experimentales diseñados para reducir la contaminación y evaluar los efectos de la contaminación;
02
Incluir incluye la evaluación de controles para el ADN contaminante. Cada lote de muestreo, extracción de ácido nucleico y amplificación debe incluir un tipo de control negativo (control de blanco de muestreo, control de blanco de extracción de ADN y control de amplificación sin plantilla);
03
Determine determina los niveles de contaminación comparando muestras biológicas con controles;
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Explore explora las poblaciones contaminantes en cada estudio e informa su impacto en la interpretación de muestras biológicas.
Diagrama Diagrama de flujo del método para minimizar el ADN contaminante en biomasa microbiana baja
De hecho, tras conocer tanto, el propósito es plantear algunas sugerencias para el estudio de comunidades microbianas de baja biomasa para evitar en lo posible la contaminación [2-3]:
1. Siempre que sea posible, maximice la biomasa inicial de la muestra mediante la selección, filtración o concentración del tipo de muestra. Si la carga microbiana es inferior a aproximadamente 103 a 104 células, es posible que no se obtengan resultados fiables debido a que predomina la contaminación.
Los resultados se pueden optimizar mediante tinción de Gram, hibridación in situ con fluorescencia (FISH), qPCR u otros métodos para la cuantificación del ADN antes de la secuenciación.
2. Minimizar el riesgo de contaminación durante la toma de muestras.
3. Para cada lote de muestras, cada kit de extracción y cada kit de PCR, se recolectan, procesan y secuencian al mismo tiempo un control negativo y muestras ambientales diana.
4. Las muestras deben procesarse en orden aleatorio para evitar patrones erróneos, idealmente por duplicado, y deben procesarse con diferentes kits/lotes de reactivos.
5. Debe documentarse qué kit se usó para procesar qué muestra, de modo que la contaminación de un número de lote específico del kit pueda rastrearse hasta el conjunto de datos final.
6. La cuantificación de las muestras de control negativo debe llevarse a cabo durante cada proceso para monitorear la ocurrencia de contaminación.
7. Después de la secuenciación, tome nota de los taxones en los controles negativos, los taxones que están asociados estadísticamente con un lote particular de reactivos y los taxones que son biológicamente insignificantes, taxones consistentes con los contaminantes informados previamente.
8. Si se considera que la presencia de flora contaminante sospechosa es significativa, se debe repetir la secuenciación usando diferentes lotes de kits/reactivos de extracción de ADN, e idealmente, se deben usar métodos que no sean de secuenciación, como el cultivo tradicional o el uso de sondas apropiadas. hibridación in situ) para confirmar aún más su verdadera existencia.
referencias
[1] Eisenhofer R, Minich JJ, Marotz C, et al. Contaminación en estudios de microbioma de biomasa microbiana baja: problemas y recomendaciones. Tendencias Microbiol. 2019
[2] Salter SJ, Cox MJ, Turek EM, et al. La contaminación de reactivos y laboratorios puede tener un impacto crítico en los análisis de microbiomas basados en secuencias. Biología BMC, 2014
[3] Nejman D, Livyatan I, Fuks G, et al. El microbioma tumoral humano está compuesto por bacterias intracelulares específicas del tipo de tumor. Ciencia. 2020