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Progreso y soluciones de la tecnología de cultivo de células T
Desde que Mullis inventó la tecnología de PCR en 1985, se ha utilizado ampliamente en la detección de moléculas de ácido nucleico. Pero, obviamente, solo puede ser un análisis cualitativo pero no cuantitativo, lo que se ha convertido en un problema importante que afecta a los investigadores. Solo 5 años después, hubo algunos intentos preliminares y se lograron buenos resultados.
Pang et al. Utilizaron un método de obtención de imágenes moleculares después de la PCR para la cuantificación [1]. La materia prima de la PCR, ATP, se marcó con 32P, se incorporó al producto y se analizó con tecnología de auto-imagen (Fig 1). La precisión es suficiente para distinguir la diferencia de dos veces la concentración. Este método es relativamente engorroso de operar e implica etiquetado radiactivo; además, su método de detección aún es un poco tosco, considerando solo el valor de densidad óptica de la banda, que pertenece a la categoría de semicuantitativo, y también necesita controlar el número de ciclos de amplificación en la fase exponencial (dentro de 30). Aunque este método no se ha utilizado ampliamente, ha supuesto un gran avance.
Fig 1. Detección autográfica de ADN genómico y ADN del VIH-1
En 1991 apareció un método cuantitativo más ampliamente utilizado, denominado PCR cuantitativa competitiva (QC-PCR) [2]. El principio es agregar una concentración conocida de plantilla de referencia interna, es decir, un competidor, a la muestra, que tiene la misma eficiencia de amplificación que el objetivo en la muestra, de modo que la relación de C a T después de que se complete la amplificación (no necesariamente en la fase exponencial) Es igual que antes de la amplificación, y el valor C: T después de la amplificación puede obtenerse mediante análisis de electroforesis, para deducir el número de dianas antes de la amplificación (Fig 2). La precisión y sensibilidad de este método ha mejorado enormemente, cuando se aplica a la detección del VIH-1, la sensibilidad puede llegar a 100 copias por reacción [3]. Pero sus deficiencias también son obvias: además de la operación un poco engorrosa, cómo diseñar un competidor es la mayor dificultad.
Fig 2. Diagrama esquemático del principio de QC-PCR (Guía de PCR competitiva de Takara)
Aunque los dos métodos anteriores no son satisfactorios, proporcionan una solución correcta para el nacimiento de qPCR: cómo establecer una relación entre la concentración del producto de PCR y la concentración inicial de la plantilla. En 1996, la publicación de Real Time Quantitative PCR marcó el nacimiento de qPCR [4]. Introduce una sonda de hidrólisis marcada con fluorescencia y recoge la señal fluorescente después de la extensión de cada ciclo de PCR. El número de ciclos necesarios para alcanzar la fase de amplificación exponencial (valor Ct, que se estandarizará al valor Cq después de la normalización) y el plantilla La concentración inicial establece una relación (Fig. 3), de modo que se puede cuantificar el número de dianas en la muestra desconocida (el principio se describirá en detalle en la siguiente sección).
Fig 3. Detección en tiempo real de la señal de fluorescencia y establecimiento de la curva estándar
Este artículo examina la precisión de este método en detalle y muestra que todavía es altamente reproducible para diferentes métodos de procesamiento de muestras. El artículo también menciona que qPCR tiene tres ventajas en comparación con los dos métodos anteriores: 1. La detección se realiza en el sistema sin la necesidad de abrir la tapa y ejecutar la electroforesis después de la PCR, lo que reduce la posibilidad de contaminación del producto; 2. Es compatible con el gen de mantenimiento como calibrador sin agregar control interno, y es posible la detección múltiple; 3. Tiempo de detección corto y acceso a la muestra La cantidad es alto. Este artículo ha sido citado más de 7000 veces (Google Scholar) y su carácter rompedor y clásico está fuera de toda duda.
Desde este artículo, han surgido varios artículos de tipo innovación tecnológica. Philip S et al. Utilizaron creativamente la tecnología de sonda para hacer curvas de fusión (Fig4) para distinguir diferentes variantes de genes de hemocromatosis [5]; Jacqueline et al. Usaron tecnología qPCR para detectar simultáneamente cuatro ácidos nucleicos retrovirales [6], y la detección múltiple se volvió más maduro. Yolanda et al revisaron la aplicación de qPCR en la determinación del número de copias, expresión de ARN y discriminación de alelos [7].
Fig 4. Tecnología de transferencia de energía por resonancia de fluorescencia (FRET) para el análisis de la curva de disolución
Michael et al. Describieron el método de combinar qPCR con antígeno y anticuerpo para detectar trazas de proteína [8], reemplazando el sistema biológico tradicional Biotina-Estreptavidina por PCR (Fig. 5). La función de amplificación de la señal es más ventajosa. La sensibilidad de detección de proteínas se mejora en dos o tres órdenes de magnitud en comparación con ELISA tradicional. Aunque este artículo no es el primero, hace que el método sea más sistemático y perfecto. En 2001, Livak propuso utilizar el conocido 2- △△ Cq para procesar datos de expresión génica [9], todo el proceso fue más refinado y simplificado; más tarde, Pfaffl y Vandesompele mejoraron los métodos de cálculo basados en diferentes condiciones experimentales [10] [11 ], las condiciones de aplicación son más realistas.
Fig 5. La principal diferencia entre la inmuno PCR en tiempo real y el ELISA tradicional
Hasta hace poco, se han publicado más tecnologías de cuantificación de ácidos nucleicos basadas en qPCR. Yanan Du et al.describieron una detección multiplex de ácidos nucleicos (Sistema EPFS, ver Fig. 6) lograda mediante PCR de emulsificación combinada con detección espectral [12]. La sensibilidad, especificidad y reproducibilidad se evaluaron en detalle.
Fig 6. Diagrama esquemático de la tecnología de PCR de emulsificación (EPFS) para espectroscopia molecular de fluorescencia
Han pasado 23 años desde que salió qPCR, y hoy, con el rápido desarrollo de la ciencia y la tecnología, se ha considerado como un "trabajo de tecnología antigua". Sin embargo, todavía podemos nutrirnos de estas antiguas actividades técnicas, cultivar intensivamente o encontrar nuevas formas; esto es lo que queremos decir cuando los árboles viejos florecen nuevas flores. En el futuro, la combinación de detección molecular de fluorescencia de ADN, tecnología de microfluidos e incluso citometría de flujo seguramente hará que la qPCR sea un estilo diferente.
referencias
1. Pang S, Koyanagi Y, Miles S, et al. Niveles elevados de ADN del VIH-1 no integrado en el tejido cerebral de pacientes con demencia por SIDA [J]. Nature, 1990, 343 (6253): 85.
2. Becker-Andre, M. Evaluación cuantitativa de los niveles de ARNm. Método Biología Celular Molecular. 1991. 2: 189-201
3. Piatak, Michael y col. "Altos niveles de VIH-1 en plasma durante todas las etapas de la infección determinados por PCR competitiva". Science 259.5102 (1993): 1749-1754.
4. Heid CA, Stevens J, Livak KJ, et al. PCR cuantitativa en tiempo real [J]. Investigación del genoma, 1996, 6 (10): 986-994.
5. Bernard, Philip S. y col. "Genotipado multiplex homogéneo de mutaciones de hemocromatosismo con sondas de hibridación fluorescentes". Revista estadounidense de patología 153.4 (1998): 1055-1061.
6. Veterinario, Jacqueline AM, et al. "Detección multiplex de cuatro retrovirus patógenos mediante balizas moleculares". Actas de la Academia Nacional de Ciencias 96.11 (1999): 6394-6399.
7. Lie YS, Petropoulos C J. Avances en la tecnología de PCR cuantitativa: ensayos de 5′nucleasa [J]. Current Opinion in Biotechnology, 1998, 9 (1): 43-48.
8. Adler M, Wacker R, Niemeyer C M. Un ensayo de inmuno-PCR en tiempo real para la cuantificación rutinaria ultrasensible de proteínas [J]. Comunicaciones de investigación bioquímica y biofísica, 2003, 308 (2): 240-250.
9. Livak KJ, Schmittgen T D. Análisis de datos de expresión génica relativa mediante PCR cuantitativa en tiempo real y el método 2− ΔΔCT [J]. métodos, 2001, 25 (4): 402-408.
10. Pfaffl, Michael W. "Un nuevo modelo matemático para la cuantificación relativa en tiempo real RT-PCR". Investigación de ácidos nucleicos 29.9 (2001): e45-e45.
11. VandesompeleJ, De Preter K, Pattyn F, et al. Normalización precisa de datos de RT-PCR cuantitativos en tiempo real mediante el promedio geométrico de múltiples genes de control interno [J]. Biología del genoma, 2002, 3 (7): research0034. 1.
12. Du Y, ZhaoX, Zhao B, et al. Un nuevo método de PCR en emulsión junto con espectrofotometría de fluorescencia para la detección simultánea cualitativa, cuantitativa y de alto rendimiento de múltiples dianas de ADN [J]. Informes científicos, 2019,9 (1): 184