比对软件
来啦@-@，今天给大家分享一下几款小编常用的比对软件。
Bwa
适用范围：二代测序数据快速比对到genome上。
bwa作为序列比对界的模式软件，短小精悍，适用于多种场合，很有必要搞懂他内部的比对算法，最好也搞懂它是如何实现的。
建立索引：
bwa index in.fasta
索引建立好之后会生成五个文件，后缀分别是：
bwt,pac,ann,amb,sa
常见比对命令：
BWA-backtrack：illumina reads比对，最长支持100bp（aln/samse/sampe）
bwa aln ref.fa R1.fq > aln1_sa.sai
bwa aln ref.fa R2.fq > aln2_sa.sai
bwa sampe ref.fa aln_sa1.sai aln_sa2.saiR1.fq R2.fq > aln-pe.sam
BWA-SW：long-read比对，长度为70bp-1Mbp；支持剪切性比对（bwasw）
bwa bwasw ref.fa R1.fq R2.fq > aln-pe.sam
BWA-MEM：最新，最常用，同SW，但更准更快，与backtrack相比在70-100bp更具性能优势（mem）
bwa mem ref.fa R1.fq R2.fq > aln-pe.sam
Bowtie/Bowtie2
适用范围：将短序列拼接至模板基因组。
Bowtie在拼接35碱基长度的序列时，可以达到每小时2.5亿次的拼接速度。Bowtie并不是一个简单的拼接工具，它不同于Blast等。它适合的工作是将小序列比对至大基因组上去。它最长能读取1024个碱基的片段。换言之，bowtie非常适合下一代测序技术。
Bowtie2 是将测序reads与长参考序列比对工具。适用于将长度大约为50到100或1000字符的reads与相对较长的基因组（如哺乳动物）进行比对。Bowtie2使用FM索引（基于Burrows-Wheeler Transform 或 BWT）对基因组进行索引，以此来保持其占用较小内存。对于人类基因组来说，内存占用在3.2G左右。Bowtie2 支持间隔，局部和双端对齐模式。可以同时使用多个处理器来极大的提升比对速度。如果目的是与相对较短的参考序列（如细菌基因组）非常灵敏的比对，可以使用Bowtie 2完成，但您可能需要考虑使用NUCmer，BLAT或BLAST等工具。当参考基因组很长时，这些工具可能会非常缓慢，但当参考基因组很短时通常就足够了。
建立索引：
bowtie2-build genome.fa genome_index
bowtie2 -p 10 -x genome_index -1 input_1.fq -2 input_2.fq | samtools sort -O bam -@ 10 -o - > output.bam
需要注意的是：genome_index 指的是用于bowtie2的索引文件，而不是参考基因组本身，构建过程参考后文。genome_index 需要指定路径及其共用文件名
RNA-seq比对软件
RNA测序并不能直接使用DNA测序常用的BWA、Bowtie等比对软件，这是由于真核生物内含子的存在，导致测到的reads并不与基因组序列完全一致，因此需要使用Tophat/HISAT/STAR等专门为RNA测序设计的软件进行比对。
01 Tophat2
可以说是最被公认的RNA测序比对软件(实际上是在DNA比对软件Bowtie的基础上做了一个壳,tophat调用bowtie，tophat2调用bowtie2)。
02 HISAT2
在Tophat的算法基础了上做了大量的改进，而且克服了Tophat最大的缺点——速度慢(HISAT2既能做RNA-seq也能做DNA-seq)。
①Hisat是一种高效的RNA-seq实验比对工具
②它使用了基于BWT和Ferragina-manzini (Fm) index 两种算法的索引框架
③使用了两类索引去比对，一类是全基因组范围的FM索引来锚定每一个比对，另一类是大量的局部索引对这些比对做快速的扩展
建立索引,它的索引就会以genome命名，以*.ht2结尾
hisat2-build -f ref.fasta genome -p 10
而遇到一些大的基因组的时候我们需要用到一个命令参数–large-index，强制要求产生的索引为‘large’
线程数比对基本的用法：
hisat2 [options]* -x <ht2-idx> {-1 <m1> -2 <m2> | -U <r>} [-S <sam>]
hisat2 -x genome -1 ./data/gpl/gpl_L4_383X83.R1.fastq.gz -2 ./data/gpl/gpl_L4_383X83.R2.fastq.gz -S test.sam
03 STAR
STAR （Spliced Transcripts Alignment to a Reference），用于将测序的 Read 对齐到参考基因组的比对软件，常用于 RNAseq。因其具有较高的准确率，映射速度较其他比对软件高 50 多倍，因此作为 ENCODE 项目的御用 pipeline 工具。它需要占用大量内存，对计算资源有较高的要求。STAR 的默认参数针对哺乳动物基因组进行了优化.
建立索引：
STAR --runMode genomeGenerate \
--runThreadN 50 \
--genomeDir ./hg38_index \
--genomeFastaFiles ./genome.fa \
--sjdbGTFfile ./genes.gtf \
--sjdbOverhang 99
参数：
–runMode genomeGenerate：基因组生成模式
–runThreadN：启用线程数
–genomeDir：索引输出路径
–genomeFastaFiles：参考基因组路径
–sjdbGTFfile：参考基因组注释文件
–sjdbOverhang：对于不同长度的读取，理想值为--sjdbOverhangmax(ReadLength)-1。在大多数情况下，默认值 100 与理想值类似。
STAR 比对：
STAR --outSAMtype BAM SortedByCoordinate \
--runThreadN 20 \
--genomeDir ./hg38_index \
--readFilesIn seq_data_1.fastq seq_data_2.fastq \
--outFileNamePrefix ./seq_data
参数：
–runThreadN：启用线程数
–genomeDir：索引路径
–readFilesIn：输入 fastq 的文件路径
–outSAMtype BAM SortedByCoordinate：输出排序的 bam 文件
–outFileNamePrefix：输出文件前缀
04 MapSplice
TCGA使用的比对软件。
05 RSEM
RSEM更像一个软件包而不是一个比对软件，能够提供从比对到计算差异表达的所有步骤，由于不需要自己写代码串联不同软件生成的数据格式，因此用起来比较省时省力，值得注意的是，TCGA使用MapSplice比对后再用RSEM计算表达量，并没有直接只用RSEM原装的Bowtie的比对结果。
①比对软件（RNA-SEQ比对到参考基因组上）：bowtie2 tophat hista2 star
②不需要比对（伪比对，基于建立好的参考转录组）：sailfish kallsto salmon
③组装与定量：stringtie cufflink RSEM
性能比较：
①tophat与Hista2算法相似，但是tophat已经不再维护，且比对速度方面，Hista2 显著高于 tophat。STAR与Hista2类似。
②Ballgown在差异分析方面比cuffdiff更高的特异性及准确性，且时间消耗不到cuffdiff的千分之一
③Bowtie2+eXpress做质量控制优于tophat2+cufflinks和bowtie2+RSEM
长片段比对软件
01 Minimap2
Minimap2是针对于三代测序数据进行比对的工具，minimap2的优势是速度快，而且听说比对的结果也比较不错；缺点呢，就是耗费内存。基本用法如下：
建立索引：
minimap2 -d co92.min co92.fna
比对：
minimap2 -ax map-pb azyz.genome.fasta azyz.flnc.fasta > aln.sam
分类：五大类，索引（Indexing），回帖（Mapping），比对(Alignment),输入/输出（Input/Output）,预设值（Preset）。
-x ：非常中要的一个选项，软件预测的一些值，针对不同的数据选择不同的值
map-pb/map-ont: pb或者ont数据与参考序列比对；
ava-pb/ava-ont: 寻找pd数据或者ont数据之间的overlap关系；
asm5/asm10/asm20: 拼接结果与参考序列进行比对，适合~0.1/1/5% 序列分歧度；
splice: 长reads的切割比对
sr: 短reads比对
-d :创建索引文件名
-a ：指定输出格式为sa格式，默认为PAF
-Q ：sam文件中不输出碱基质量
-R ：reads Group信息，与bwa比对中的-R一致
-t：线程数，默认为3
02 ngmlr
NextGenMap-LR(ngmlr)主要用于三代测序的长reads与参考基因组的比对。NGMLR是一款为长reads设计的快速且高精度的进行比对的软件，它是基于NGM开发的，该软件扩展了segmented convex gap-cost scoring model来适应高错误率的长reads比对。
基本用法：
ngmlr -r ucsc.hg19.fasta -q XXX.fastq -o YYY.bam
下图是几款软件的比较：
可以看出minimap2表现是十分良好的。
