PBMC scATAC-seq の解析 (公式チュートリアル)
10x Genomics が提供するヒト末梢血単核球 (PBMC) の単一細胞 ATAC-seq データセットの分析
1. Signac のインストールおよびロード プロセスのすべてのインストール パッケージ
install.packages("Signac")
install.packages("BiocManager")
install.packages("EnsDb.Hsapiens.v75")
install.packages("Seurat")
install.packages("spatstat.utils")
install.packages("spatstat.geom", dependencies = TRUE)
install.packages("hdf5r")
BiocManager::install("biovizBase")
library(EnsDb.Hsapiens.v75) ##这个包用于人类的基因组注释文件
library(patchwork)
library(Signac)
library(Seurat)
library(ggplot2)
library(hdf5r)
library(spatstat.geom)
library(biovizBase)
2. データをインポートして Signic オブジェクトを作成する
入力ファイルの紹介
Signac には 2 つの入力ファイルが必要ですが、どちらも CellRanger によって取得できます。
（1）ピーク/セルマトリックス：
横軸は各ピーク面積、縦軸は各セルである。単一細胞の遺伝子発現数マトリックスと同様に、
各ピーク領域は予測された各クロマチンのオープン領域を表し、
マトリックスの値はこのピーク位置で細胞によって結合された Tn5 酵素の数を表します。
（2）フラグメントファイル：
このファイルは、すべての単一セル内のすべての一意のフラグメントを含むリストです。
このファイルは非常に大きく、通常はディスク (ディスク) に保存され、メモリ (メモリー) にインポートする必要はありません
。このファイルはセルを表示するためのものです。ピーク内のフラグメントだけでなく、フラグメント内のすべてのフラグメント
setwd("D:/R/Signac.pipeline/data") ##设置工作路径
# 读入CSV描述数据属性文件到metadata
metadata <- read.csv(
file = "D:/R/Signac.pipeline/data/atac_v1_pbmc_10k_singlecell.csv",
header = TRUE,
row.names = 1
)
# 读入Peak/Cell matrix
counts <- Read10X_h5(filename = "D:/R/Signac.pipeline/data/atac_v1_pbmc_10k_filtered_peak_bc_matrix.h5")
# ATAC-seq的数据（peak和fragment）被整合并储存在一种特殊的assays（ChromatinAssay）
chrom_assay <- CreateChromatinAssay(
counts = counts,
sep = c(":", "-"),
genome = 'hg19',
fragments = 'D:/R/Signac.pipeline/data/atac_v1_pbmc_10k_fragments.tsv.gz',
min.cells = 10,
min.features = 200
)
# 将（ChromatinAssay）创建为seurat对象
pbmc <- CreateSeuratObject(
counts = chrom_assay,
assay = "peaks",
meta.data = metadata
)
#通过打印这个peaks的assays，可看其中的附加信息motif information、 gene annotations、genome information
pbmc[['peaks']]
#可以使用grangs函数应用于Seurat对象 或者 “pbmc@assays$peaks@ranges”直接获取每个peaks在基因组上的ranges（范围）
granges(pbmc)
pbmc@assays$peaks@ranges
87561 の範囲と 0 のメタデータ列を持つ GRanges オブジェクト:
seqnames ranges struct
[1] chr1 565107-565550*
[2] chr1 569174-569639*
[3] chr1 713460-714823*
[4] chr1 752422-753038*
[5] chr 1 762106 -763359 *
... ... ... ... [87557] chrY 58993392-58993760 * [87558] chrY 58994571-58994823 * [87559] chrY 58996352-58997331 * [87560] chrY -5 9002175 * [
87561
] chrY 59017143-59017246 *
--- ---- 配列: 不特定のゲノムからの 24 個の配列。シーケンス長がありません
3. pbmcオブジェクトにヒトゲノムの遺伝子のアノテーションを追加する
# 我们可以向pbmc对象中添加人类基因组的gene的注释，下游函数（FUNCTION）就可以直接从seurat对象中提取gene的注释用于分析（如，画track）
BiocManager::install("AnnotationHub")
library(AnnotationHub)
hub <- AnnotationHub()
query(hub, c("Homo sapiens","ensdb"))##检索ensdb数据中人类基因组
homo_ensdb <- hub[["AH53211"]]##提取某个注释文件
#library(EnsDb.Hsapiens.v75)
#从Ensb包中获取hg19版本人基因组注释
annotations <- GetGRangesFromEnsDb(ensdb = EnsDb.Hsapiens.v75)
#将注释文件由EnsDb格式转换为GRanges格式
seqlevelsStyle(annotations) <- "UCSC"
#给pbmc对象设置注释文件
Annotation(pbmc) <- annotations
四、QC指標の計算
ヌクレオソーム バンディング パターン - Signic に固有
# compute nucleosome signal score per cell
pbmc <- NucleosomeSignal(object = pbmc)
pbmc$nucleosome_group <- ifelse(pbmc$nucleosome_signal > 4, 'NS > 4', 'NS < 4')
FragmentHistogram(object = pbmc, group.by = 'nucleosome_group')
#可见，单核小体/无核小体比率（the mononucleosomal / nucleosome-free ratio）的异常值细胞具有不同的核小体条带模式
転写開始部位 (TSS) エンリッチメント スコア
# compute Transcriptional start site (TSS) enrichment score
pbmc <- TSSEnrichment(object = pbmc, fast = FALSE)
# 当fast=T时，仅计算TSS分数，而不存储每个细胞Tn5插入频率的位置矩阵，这样后续将不能使用TSSPlot画图。
# 基于TSS分数将不同的细胞进行分组以及画所有TSS位点的可及性信号图来检查TSS富集分数
pbmc$high.tss <- ifelse(pbmc$TSS.enrichment > 2, 'High', 'Low')
TSSPlot(pbmc, group.by = 'high.tss') + NoLegend()
pbmc$pct_reads_in_peaks <- pbmc$peak_region_fragments / pbmc$passed_filters * 100 #将peaks中reads的比例加进来
pbmc$blacklist_ratio <- pbmc$blacklist_region_fragments / pbmc$peak_region_fragments #将blacklist区域中reads比例加进来
##画上述5个指标的小提琴图
VlnPlot(
object = pbmc,
features = c('pct_reads_in_peaks', 'peak_region_fragments',
'TSS.enrichment', 'blacklist_ratio', 'nucleosome_signal'),
pt.size = 0.1,
ncol = 5
)
# pct_reads_in_peaks: （reads富集到peaks区域的百分比）是指所有测序reads中被分配到基因组区域中ATAC-seq峰的百分比。pct_reads_in_peaks的计算可以帮助评估ATAC-seq测序数据的质量和信噪比，因为在良好的实验和数据处理条件下，ATAC-seq数据中大部分的reads应该能够映射到ATAC-seq峰的区域中。较高的pct_reads_in_peaks通常表示ATAC-seq测序数据较为可靠，但也可能与样本中存在更多开放的区域相关。
# peak_region_fragments：每个ATAC-seq峰区域内包含的ATAC-seq测序片段数。每个峰表示基因组上的一段区域，其相对于周围区域具有更高的ATAC-seq信号。较高的peak_region_fragments通常表示较高的ATAC-seq数据信噪比和较高的峰质量。在一些情况下，peak_region_fragments也可以用于比较不同样本或不同实验之间的差异性和一致性。
# TSS.enrichment：（转录起始位点富集度）是指在基因组上具有转录起始位点(TSS)的区域在scATAC-seq数据中出现的比例，与在基因组上随机区域的出现比例相比较得出。转录起始位点(TSS)是指基因的起始位置，是转录调控和基因表达的重要区域。在scATAC-seq中，对每个单细胞的ATAC-seq信号进行peak calling后，可以使用一系列方法来评估每个细胞的TSS富集度，从而鉴定细胞中的基因表达和调控元件。TSS.enrichment是衡量一个细胞是否富集TSS区域的一个指标，通常情况下，高TSS.enrichment值的细胞往往与较高的基因表达水平相关联，因此可以用来鉴定不同细胞类型和状态的基因表达和调控元件。
# blacklist_ratio：（黑名单比率）是指在ATAC-seq数据分析中，被标记为"黑名单"的染色质区域所占的比例。黑名单是指染色质上的一些区域，这些区域往往是高度复杂的重复序列，或者是具有高度变异性的区域，如单倍型差异区域和转座子元件等。这些区域会在ATAC-seq数据的分析过程中被过滤掉，以减少假阳性信号的出现。因此，在scATAC-seq数据分析中，blacklist_ratio可以用来评估每个单细胞ATAC-seq数据的质量，如果一个细胞的blacklist_ratio很高，说明这个细胞的ATAC-seq信号被大量地过滤掉，可能需要进一步的筛选或者数据处理来获得更好的结果。
# nucleosome_signal：（核小体信号）是指某个基因组区域在ATAC-seq实验中被核小体所保护的程度。该指标通常是通过计算ATAC-seq测序数据中核小体上下游区域ATAC-seq峰的差异性来评估。ATAC-seq是通过使用转座酶打开染色质，使ATAC-seq测序数据中更容易获得开放染色质区域。但是，由于核小体的存在，染色质某些区域会被核小体所保护，从而阻碍转座酶的结合和DNA的开放。因此，ATAC-seq测序数据中，具有核小体保护的区域通常表现出较低的ATAC-seq信号。ATAC-seq是通过使用转座酶打开染色质，使ATAC-seq测序数据中更容易获得开放染色质区域。但是，由于核小体的存在，染色质某些区域会被核小体所保护，从而阻碍转座酶的结合和DNA的开放。因此，ATAC-seq测序数据中，具有核小体保护的区域通常表现出较低的ATAC-seq信号。
##去除不符合上述5个指标的细胞
pbmc <- subset(
x = pbmc,
subset = peak_region_fragments > 3000 &
peak_region_fragments < 20000 &
pct_reads_in_peaks > 15 &
blacklist_ratio < 0.05 &
nucleosome_signal < 4 &
TSS.enrichment > 2
)
pbmc
5. 標準化と線形次元削減
標準化・正規化（正規化）
Signac は、用語周波数逆文書周波数 (TF-IDF) 法に基づいて正規化されます。2 段階 (水平方向と垂直方向の 2 次元) の正規化操作、つまり、セル シーケンスの深さの違いを補正するクロスセル正規化を実行します (各ピークに異常なセル分布がないことがわかります)。クロスピーク正規化により、まれなピークに対してより高い値が得られます
機能の選択
scATAC-seq は変動性が低いため (DNA が測定されるため、各ピークで測定できる各細胞の数は 1 または 0 のいずれかであり、複製で検出できる可能性が最も高い細胞は 4 です)、 scRNA-seq データのような非常に多様な特徴をスクリーニングするのは困難です。別の方法として、次元削減のために上位 n% のピークのみを選択します。または、n 未満のセルでのみ検出されるピークを削除します (FindTopFeature() 関数を使用します)。ここでは通常、実行を高速化するために次元削減方法を選択します (上位 25% のピークを使用するには、min.cutoff を「q75」に設定します)。 (次元を削減したサブセットとすべてのピークを使用して得られた結果が類似していることが判明したため)
寸法削減
次に、特異値分解 (SVD) メソッドを使用して TD-IDF 行列の次元を削減し、前のステップでフィルター処理されたピーク (特徴) を使用します。これにより、このオブジェクトの低次元 LSI 表現が返されます (次のようになります)。 scRNA-seq PCA 内）TF-IDF の後に SVD を継続するこの手法は、有名な潜在的セマンティック インデクシング (LSI) 手法です
pbmc <- RunTFIDF(pbmc) # （Normalization）
pbmc <- FindTopFeatures(pbmc, min.cutoff = 'q0 ') # (Feature selection)
pbmc <- RunSVD(pbmc) # (Dimension reduction)
#通常在进行完线性降维后，得到的第一个LSI所代表的通常为技术差异，而非生物学差异，我们一般将第一个LSI去除。
#可以使用DepthCor函数评估每个LSI成分与测序深度之间的相关性
DepthCor(pbmc)
# 测序深度和每个降维分量LSI之间的相关性：由图可知，LSI_1与depth之间存在非常强的负相关性，说明LSI_1这个维度反映的是不同细胞之间测序深度之间的差异而不是生物学本身的差异，因此我们去除这个第一个LSI后再执行下游步骤。
6. 非線形次元削減とクラスタリング
# 使用 RunUMAP() 函数对 pbmc 对象进行降维操作，其中 reduction 参数指定使用的降维方法为 LSI（Latent Semantic Indexing，隐含语义索引），dims 参数指定保留的维度范围为 2 到 30。
pbmc <- RunUMAP(object = pbmc, reduction = 'lsi', dims = 2:30)
# 使用 FindNeighbors() 函数基于降维后的数据计算样本之间的距离（通常使用欧氏距离或 Pearson 相关系数），并构建一个邻接图，其中 reduction 和 dims 参数与第一行代码相同。
pbmc <- FindNeighbors(object = pbmc, reduction = 'lsi', dims = 2:30)
# 使用 FindClusters() 函数对邻接图进行聚类，其中verbose参数表示是否输出聚类过程的详细信息，algorithm参数表示使用的聚类算法，这里指定为第三种算法（Shared Nearest Neighbor，共享最近邻）。聚类结果将被存储在 pbmc@ident 中。
pbmc <- FindClusters(object = pbmc, verbose = FALSE, algorithm = 3)
# 使用 DimPlot() 函数对聚类结果进行可视化，其中 object 参数指定数据对象为pbmc，label参数表示是否在图上标注聚类结果，NoLegend() 函数表示不显示图例。
DimPlot(object = pbmc, label = TRUE) + NoLegend()
遺伝子活性マトリックスの作成
遺伝子関連クロマチン領域のアクセス可能性を評価することでゲノム全体の遺伝子活性を定量化し、scATAC-seq データから遺伝子活性の新しい表を作成できます。ここでは単純なアプローチのみを採用します。つまり、発現行列を作成するには、各遺伝子の座標を抽出してその上流 2kb 領域まで拡張し、各細胞内で上記領域にマッピングされる断片の数を数えます。 、このステップはFeatureMatrix()関数を使用して実行できますが、このステップはGeneActivity()関数で自動的に実行されます。
#GeneActivity() 函数自动执行创建基因活性表达矩阵这一步骤
gene.activities <- GeneActivity(pbmc)
#将活性矩阵添加到pbmc对象中，作为一个新的名为"RNA"的assays，并进行标准化。
pbmc[['RNA']] <- CreateAssayObject(counts = gene.activities)
pbmc <- NormalizeData(object = pbmc,assay = 'RNA',normalization.method = 'LogNormalize',scale.factor = median(pbmc$nCount_RNA))
DefaultAssay(pbmc) <- 'RNA'
#使用经典的标记基因（marker genes）的活性值可视化来帮助我们解释ATAC-seq簇。但是这个估计比scRNA-seq数据的估计的噪音值更大，这是因为ATAC-seq所代表的基因活性值与基因的表达不总是相对应的。
FeaturePlot(
object = pbmc,
features = c('MS4A1', 'CD3D', 'LEF1', 'NKG7', 'TREM1', 'LYZ'),
pt.size = 0.1,
max.cutoff = 'q95',
ncol = 3
)
7. scRNA-seq データとの統合 (scRNA-seq データとの統合)
ATAC-seq データの解釈を支援するために、同じ生物学的システムからの scRNA-seq データに基づいて細胞を分類することができます。
ラベルトランスファー (ラベルトランスファー) とマルチオミクスデータ統合 (クロスモダリティ統合) を使用します。目標は、遺伝子活性マトリックスベースの scATAC-seq データと遺伝子発現ベースの scRNA-seq データにおける共通の相関パターンを特定し、両方のモダリティの生物学的データを一致させることです。
#加载下载后的PMBC的scRNA-seq的Seurat对象
pbmc_rna <- readRDS("D:/R/Signac.pipeline/data/pbmc_10k_v3.rds")
transfer.anchors <- FindTransferAnchors(
reference = pbmc_rna,
query = pbmc,
reduction = 'cca')# 经典关联算法（Classical association algorithm，CCA） 本用于解决批次效应，此处用于整合RNA（reference）和ATAC（query）两个模态的数据，即找到RNA和ATAC之间的Anchors )
predicted.labels <- TransferData( #预测的细胞标签
anchorset = transfer.anchors,
refdata = pbmc_rna$celltype,
weight.reduction = pbmc[['lsi']],
dims = 2:30
)
pbmc <- AddMetaData(object = pbmc, metadata = predicted.labels) #将预测的细胞标签加入pmbc的meta.data中
##绘图对两种数据进行可视化
plot1 <- DimPlot(object = pbmc_rna,group.by = 'celltype',label = TRUE,repel = TRUE) + NoLegend() +ggtitle('scRNA-seq')
plot2 <- DimPlot(object = pbmc,group.by = 'predicted.id',label = TRUE,repel = TRUE) + NoLegend() + ggtitle('scATAC-seq')
plot1 + plot2
# 根据图可以看到scRNA-seq的分类与我们仅基于scATAC-seq的数据几乎一致，我们可以很方便的注释scATAC-seq的细胞簇
pbmc <- subset(pbmc, idents = 14, invert = TRUE)
pbmc <- RenameIdents(
object = pbmc,
'0' = 'CD14 Mono',
'1' = 'CD4 Memory',
'2' = 'CD8 Effector',
'3' = 'CD4 Naive',
'4' = 'CD14 Mono',
'5' = 'DN T',
'6' = 'CD8 Naive',
'7' = 'NK CD56Dim',
'8' = 'pre-B',
'9' = 'CD16 Mono',
'10' = 'pro-B',
'11' = 'DC',
'12' = 'NK CD56bright',
'13' = 'pDC'
)
8. 異なるセルクラスター間の異なるアクセス可能性のピークを特定する (クラスター間で異なるアクセス可能性のピークを見つける)
# 这一步耗时长，我们仅对 Naive CD4 cells 和 CD14 monocytes进行比较查看差异peaks
DefaultAssay(pbmc) <- 'peaks' #将默认的assays转换回peaks
da_peaks <- FindMarkers(
object = pbmc,
ident.1 = "CD4 Naive",
ident.2 = "CD14 Mono",
test.use = 'LR',
latent.vars = 'peak_region_fragments'
)
head(da_peaks)
plot1 <- VlnPlot(
object = pbmc,
features = rownames(da_peaks)[1],#对第一显著的差异peaks画小提琴图
pt.size = 0.1,
idents = c("CD4 Naive","CD14 Mono")
)
plot2 <- FeaturePlot(
object = pbmc,
features = rownames(da_peaks)[1],#对第一显著的peaks画feature图
pt.size = 0.1
)
plot1 | plot2
DA テスト方法を使用することに加えて、2 つの細胞グループの Fold Change アクセシビリティを比較することによって DA 領域を特定することもできます。
この方法は、DA テストを実行する方法よりもはるかに高速である可能性がありますが、この方法では統計的な分析は実行されません。セル間のシーケンス深度の違いによる影響などの影響は避けられませんが、
この方法を使用するとデータを迅速に探索でき、FoldChange() 関数で上記の操作を実行できます。
# 通过FoldChange函数比较两组细胞的Fold Change accessibility 来鉴定DA（differentially accessible）区域
fc <- FoldChange(pbmc, ident.1 = "CD4 Naive", ident.2 = "CD14 Mono")
head(fc)
純粋なピーク座標を単独で説明するのは難しいため、ClosestFeature() 関数を使用してこれらのピークに最も近い遺伝子を見つけます。遺伝子のリストを見ると、ナイーブ T 細胞の開いたピークは BCL11B や GATA3 (T 細胞分化の重要な調節因子) などの遺伝子に近く、単球の開いたピークは CEBPB (単球分化の重要な調節因子) に近いことがわかります。 ) 因子)
これらの遺伝子に近い遺伝子も、遺伝子が見つかった後に濃縮することができ、GOstats を使用して濃縮解析を実行できます。
open_cd4naive <- rownames(da_peaks[da_peaks$avg_log2FC > 3, ])
open_cd14mono <- rownames(da_peaks[da_peaks$avg_log2FC < -3, ])
closest_genes_cd4naive <- ClosestFeature(pbmc, regions = open_cd4naive)
closest_genes_cd14mono <- ClosestFeature(pbmc, regions = open_cd14mono)
head(closest_genes_cd4naive)
head(closest_genes_cd14mono)
9. ゲノム領域のプロット (ゲノム ATAC シグナル可視化)
# 我们可以使用该函数绘制基因组区域间Tn5整合的频率，这些区域是根据细胞簇、细胞类型或存储在对象中的任何其他元数据进行分组的;
levels(pbmc) <- c("CD4 Naive","CD4 Memory","CD8 Naive","CD8 Effector","DN T","NK CD56bright","NK CD56Dim","pre-B",'pro-B',"pDC","DC","CD14 Mono",'CD16 Mono')
CoveragePlot(
object = pbmc,
region = rownames(da_peaks)[1],
extend.upstream = 40000,
extend.downstream = 20000
)
参考文献:
Signic 公式: https://stuartlab.org/signac/articles/pbmc_vignette.html
短編本: https://www.jianshu.com/p/80ce771bb921