继去年在《Molecular Nutrition and Food Research》上发表研究论文、并被选为MNFR期刊当期的封面文章（【派森诺项目文章】荣登MNFR封面，多组学整合研究再立新功！）之后，近期，派森诺的长期合作伙伴——中国海洋大学的易华西教授团队，和新加坡国立大学王炯伟教授团队在生物医学1区期刊《Theranostics》上发表论文：继续以小鼠为模型，研究了牛乳来源的细胞外囊泡（mEVs）通过调节小鼠的肠道免疫和肠道菌群来缓解结肠炎的作用机理，旨在探讨mEVs对结肠炎的治疗作用。
研究背景
mEVs是牛奶中重要的活性成分。它作为纳米颗粒，在细胞间通信中起关键作用，正被开发为新型药物载体。不过，mEVs对肠道菌群和肠道免疫的影响尚不清楚。因此，易教授团队以小鼠为模型，就mEVs对肠道菌群和免疫功能的影响开展了一系列的研究。
研究方法
研究对象
C57BL/6小鼠
测序技术
Illumina MiSeq PE300微生物组测序+miRNA测序+蛋白质组检测
测序模式
多样性组成谱16S rRNA基因V4V5区测序
实验设计
对照组、DSS组（3% DSS）、DSS + mEVs-L组（3% DSS + 0.6 mg/kg/d，低剂量）、DSS + mEVs-M组（3% DSS + 1.8 mg/kg/d，中剂量）、DSS + mEVs-H组（3% DSS + 3.0 mg/kg/d，高剂量）
研究结果
- mEVs的蛋白质组学和miRNA功能分析
首先，本文利用蛋白质组学和miRNA测序发现mEVs中含有大量与免疫相关的蛋白质和miRNAs，并参与了免疫和炎症通路的调控。比如，GO注释表明，大多数蛋白质参与了生物过程和细胞成分；KEGG注释表明，排名前20位的KEGG通路，其中8条通路（红框）参与了炎症信号通路，包括人巨细胞病毒感染、PI3K/Akt信号通路、趋化因子信号通路、MAPK信号通路等；另外，在mEVs中共鉴定出678个miRNAs，并发现前100个miRNA中有36个靶向炎症途径，其中包括10个与IBD（Idiopathic inflammatory bowel disease）有关的miRNA。
- mEVs在DSS诱导的溃疡性结肠炎中修复肠道免疫
研究发现，经DSS处理的小鼠体重逐渐减轻；而mEVs治疗显著防止DSS诱导的溃疡性结肠炎（UC）小鼠的体重下降和结肠长度缩短。此外，H&E和天狼猩红染色显示，mEVs减轻了UC小鼠肠上皮的破坏、炎症细胞浸润和纤维化组织的生成。细胞因子紊乱是结肠炎的主要特征之一，IBD中出现的促炎细胞因子和抗炎细胞因子之间的不平衡阻碍了炎症的缓解。在DSS诱导小鼠的血清和结肠组织中观察到多种细胞因子的显著增加。相反，mEVs治疗抑制了DSS诱导的IL-1β、TNF-α、IL-6、IL-2和IL-22的上调。此外，结肠炎症和氧化应激的关键标志——髓过氧化物酶（MPO）的活性在DSS诱导的小鼠中显著增加，然而mEVs处理抑制了DSS诱导小鼠MPO活性的升高。这些结果表明，mEVs可以通过抑制促炎细胞因子的产生来预防小鼠结肠炎。
- mEVs在体内外的免疫调节机制
在体外和UC小鼠模型中，mEVs均可抑制TLR4-NF-κB信号通路和NLRP3信号通路介导的炎症反应。
在模拟体外实验中发现，与LPS组相比，mEVs以剂量依赖性的方式下调TLR4和Myd88的蛋白水平。LPS刺激后，p65蛋白在细胞核中的表达明显增加，在细胞质中的表达明显减少，而mEVs则逆转了p65在细胞核和细胞质中的细胞分布。这些结果表明，mEVs可以抑制p65向核内转位，从而抑制NF-κB信号通路的激活。此外，NLRP3信号通路中的前caspase-1和NLRP3的表达在LPS诱导的细胞中被上调，mEVs也以剂量依赖性的方式逆转其表达。
在小鼠模型（体内实验）中，为了确定mEVs在DSS诱导的结肠炎模型中的免疫调节机制，本文通过western blotting、免疫组化和RT-PCR检测TLR4-NF-κB和NLRP3信号通路中几个关键调控因子的表达。在DSS处理小鼠中，TLR4、Myd88、COX2、磷酸化-IκBα和p65蛋白的表达水平显著升高，mEVs可有效抑制TLR4-NF-κB信号通路成分的变化。同样，mEVs处理在mRNA水平上抑制了DSS处理小鼠中TLR4、Myd88和iNOS的上调。与TLR4-NF-κB信号通路类似，在DSS诱导小鼠中，NLRP3信号通路关键成分，包括NLRP3、凋亡相关斑点样蛋白（ASC）和前caspase-1的表达增加。这些结果表明，mEVs可抑制TLR4-NF-κB和NLRP3信号通路，从而预防小鼠结肠炎。
- mEVs修复溃疡性结肠炎肠道菌群失衡，调节肠道免疫
16S rRNA基因测序的结果表明，在DSS诱导的结肠炎中，肠道菌群的多样性降低，而在mEVs处理后，多样性适度恢复。评价肠道微生物群落丰富度和多样性的α多样性指数，比如Chao 1指数、Shannon指数、Observed species指数和Faith_pd指数在DSS诱导下均显著降低，而mEVs处理有效地恢复了肠道微生物群落的α多样性。PCoA分析和物种的差异分析同样显示，mEVs可以重塑DSS诱导小鼠的肠道菌群，使其恢复到正常的微生物群落结构。
最后，为了进一步探讨mEVs在结肠炎中如何调节肠道免疫和肠道菌群，本研究对肠道菌群和免疫炎症因子进行了Spearman关联分析。结果表明，Enterococcus、Turicibacter、Helicobacter、Desulfovibrionaceae、unclassified Desulfovibrionaceae和Mogibacteriaceae等有害细菌的增加与DSS诱导的结肠炎中促炎细胞因子和免疫炎症通路关键基因的表达呈正相关；而Akkermansia、S24_7、Paraprevotella、Verrucomicrobiaceae等有益菌的减少则与这些基因的表达呈负相关，从而揭示了mEVs可通过肠道菌群调节肠道免疫稳态来预防小鼠结肠炎。
研究总结
本文研究了mEVs对溃疡性结肠炎的治疗作用及其可能的机制，证明了mEVs含有丰富的蛋白质和microRNAs参与免疫调节，并利用体外和体内炎症模型进一步评估了mEVs对肠道免疫和肠道菌群的影响。结果表明mEVs可抑制TLR4-NF-κB信号通路和NLRP3信号通路介导的炎症反应；口服mEVs可通过恢复肠道细胞因子稳态、调节免疫细胞平衡以及改善肠道菌群失调等方式来共同缓解小鼠结肠炎。