派森诺与江西农业大学张锦华老师课题组合作，在微生物基因组领域的《Scientific Reports》发表研究成果！该研究从腹泻仔猪的肠道内容物中分离得到了一株A型的产气荚膜梭菌JXJA17，对其进行了全基因组测序和比较基因组分析，为进一步研究β2毒素与仔猪腹泻的关系提供了依据。
01、研究背景
产气荚膜梭菌（C. perfringens，Cp）是一种普遍存在的革兰氏阳性杆状厌氧细菌，根据其产生的四种毒素，将其分为A-F七种类型。Cp是人类和动物的常见病原体，是一种条件致病菌，会导致气体坏疽、腹泻和食物中毒等疾病发生，并生成相关的毒素和毒力因子（A-F型的Cp产生的毒素超过18种）。CpA主要由两个cpb2等位基因编码产生α毒素和β2毒素（β2毒素分为两类：典型和非典型），而典型β2毒素被认为和从猪上分离得到的C. perfringens有关，但是关于CpA β2毒素的发病机制及CpA的全基因组研究较少。
本研究从腹泻仔猪的肠道内容物中分离得到229株Cp，经毒素分型鉴定为CpA。根据小鼠毒性实验和兔子回肠实验发现，该菌株携带cpb2基因，且比不携带cpb2基因的健康仔猪分离到的CpA具有更高的致病性。为了更好地鉴定腹泻仔猪CpA的β2毒素，故对C. perfringens JXJA17菌株进行了全基因组测序，并对cpb2基因进行了分析。
02、研究材料与方法
1.实验材料：腹泻仔猪的肠道内容物中分离得到的A型C. perfringensJXJA17菌株
2.测序平台：Illumina Miseq+Pacbio
3.分析内容：细菌完成图测序、毒力和耐药基因分析、进化树构建、共线性分析
03、研究结果
1.菌株JXJA17的基因组特征
本次测序采用了Illumina Miseq和Pacbio Sequel平台进行高通量测序，其中Illumina Miseq平台测序得到了5,250,394条高质量reads和1,283,480,560bp的高质量数据，Pacbio Sequel平台得到了163,553条reads和1,302,938,004bp数据量，测序的GC含量为32.67%，本次测序基因组的测序深度为357X。菌株JXJA17的全基因组测序组装后得到1条染色体和9个质粒，染色体的长度为3,324,072bp，GC含量为28.51%，基因预测得到2967个ORF，30个rRNA和95个tRNA（图1）。剩下9个质粒的JXJA17_p1-JXJA17_p9的质粒大小分别为58,796bp、38,284bp、62,027bp、40,125bp、36,275bp、12,326bp、12,133bp、3,550bp和11,801bp，非编码RNA预测发现JXJA17_p2携带一个tRNA和一个ncRNA外，其余质粒均不携带rRNA、tRNA和其他ncRNA。CRISPR预测得到一个CRISPR结构，该序列长2,865bp，重复了44次，由43个间隔序列，其中每个重复长度为26bp，间隔序列的平均长度为29bp。
图1：菌株JXJA17染色体基因组圈图
对菌株JXJA17基因组进行COG注释，结果发现由7个分类占比较大，分别是：R（功能预测，268个ORFs，9.03%）；G（碳水化合物运输和代谢，199个ORFs，6.71%）；S（未知功能，192个ORFs，6.47%）；E(氨基酸运输和代谢，180个ORFs, 6.07%)、L(复制、重组和修复，169个ORFs, 5.70%)、J(翻译、核糖体结构和生物发生，160个ORFs, 5.39%)、K(转录，160 orf, 5.39%)。
- 菌株JXJA17基因组同源性分析
图2：菌株JXJA17和NCBI上所有205株Cp菌株的全基因组进化树
基于菌株JXJA17和NCBI上已报道的所有205株Cp菌株的全基因组进行进化树构建，结果表明菌株JXJA17与JGS1495、Cp-06和Cp-16的亲缘关系更近，但是这3个菌株均未组装成完成图。基于JXJA17和19个Cp菌株的16s和管家基因构建进化树，结果表明JXJA17与Cp FORC_003的亲缘关系更近。分别对这五个菌株的基因组特征进行比较，结果发现菌株JXJA17和其他4株菌的遗传背景和毒素类型均不相同。
表1：基因组一般特性比较
- 菌株JXJA17中携带cpb2基因质粒的共线性分析
图3：携带cpb2基因的Cp菌株的共线性分析
测序结果显示典型cpb2基因位于菌株JXJA17_p1上，不与其他毒素（如肠毒素和ε毒素）基因和耐药基因共存。和其他携带cpb2的质粒相比，JXJA17_p1没有Tcp结合位点或插入序列（图3和表2）。对携带cpb2基因的质粒进行共线性分析，结果显示这些质粒上的基因可以分为8个不同的模板，其中cpb2基因位于蓝色区域（图4）。
表2：NCBI中携带beta2毒素的质粒的一般特性分析
图4：共线性分析
- 毒力基因和耐药基因分析
对菌株JXJA17基因组进行VFDB分析发现该菌株的染色体和质粒上携带一些重要的致病和毒力相关基因。其中发现了10个已知的毒力相关基因，如α毒素磷脂酶C基因和β2毒素基因。其他毒力因子包括产气荚膜溶解素O、巯基激活的细胞溶解素、胶原酶等等。CARD分析，得到了21个抗生素抗性基因和18个抗生素靶点相关基因，表明该菌株可能对氟诺喹酮类、达托霉素、四环素、链霉素和红霉素产生耐药性。其中JXJA17_p1上未携带耐药基因和其他毒性相关基因。
04、研究结论
1.对产气荚膜梭菌菌株JXJA17进行全基因组测序，得到1条染色体和9个质粒；
2.16s进化树和全基因组进化树分析表明，菌株JXJA17与JGS1495、Cp-06、Cp-16和Cp FORC_003具有较高的同源性，但这些分离株的遗传背景和毒素类型均不相同；
- 编码β2毒素的cpb2基因位于JXJA17_p1上，该质粒不携带其他毒力基因、耐药基因和插入序列。该质粒不携带Tcp，但含有Pcp偶联位点，是产气荚膜梭菌中的一个新的偶联毒素质粒家族；
综上所述，对菌株JXJA17的全基因组及cpb2基因的同源性分析，有助于进一步研究β2毒素与仔猪腹泻的关系。