题目回顾
题目背景
靶向治疗是治疗肿瘤疾病的一种重要方法，它具有针对性强、疗效显著等特点。现有的靶向药物通常针对特定的基因突变靶点，容易出现耐药性。目前，一种由癌症诱发的血管新生作为靶点的靶向药物研究正成为该领域研究的热点。
原发和转移性肿瘤持续生长的先决条件是肿瘤本身能诱导新的血管生成。定点清除肿瘤新生血管是一种崭新的抗癌策略，该策略通过切断肿瘤赖以生长、转移的营养来源和迁移通道以达到抗癌效果。有证据表明，肿瘤生长、扩散转移与新血管生成密切相关：（a）在肿瘤直径小于2mm时，肿瘤生长缓慢，原发肿瘤仅局部浸润，尚未发生转移，称为“潜伏期”。只有当肿瘤继续生长大于2mm时，微血管逐渐形成，肿瘤实体随之逐渐增大，进而发生扩散和转移；（b）肿瘤实体内微血管数量与肿瘤转移潜能成正相关；（c）某些血管生成素与生长因子，如VEGF、EGF、FGF等通过促进血管生长增加了肿瘤转移的概率；（d）某些血管生成抑制剂能抑制肿瘤细胞生长与转移。基于以上事实，研究血管生成抑制剂以达到阻断肿瘤转移已成为抗肿瘤研究的关键。
目前，依据肿瘤血管发生机制设计的血管抑制剂较多，归纳起来主要有细胞外基质降解抑制剂、粘附分子抑制剂、活化的内皮细胞抑制剂、血管生成因子抑制剂和细胞内信号传导阻断剂等五类。
为了研究某类药物对血管新生的作用，研究人员进行了以下实验：
对某种动物使用药物A诱导其血管新生，加入药物B作用后发现其具有逆转A造成的血管新生作用（先加入药物 A，在其作用结束并清洗后，再加入药物B），而药物B的结构类似物C对试验动物有明显的血管新生抑制作用。在对四组样品（正常对照组、加药物A组、加药物B组和加药物 C）适当处理（包括充分的培养时间和药液清洗）后，进行RNA-seq测序。本研究希望通过比对正常对照组（没有添加任何药物）、药物A添加组、药物B添加组和药物C添加组的基因表示，研究药物A诱导血管新生作用、药物B血管新生逆转作用和药物C对血管新生的抑制作用机理。
请解决以下问题：
（a）针对附件数据，建立基因表达差异的显著性检验模型，并进行相关参数估计。因费用问题实际采集的样本很少，给出提高小样本显著性检验精度的方法；
（b）在研究基因表达显著性差异时，一般假设基因表达是独立的。但事实上，生物学功能基因组的表达水平往往具有协同调节特点（inherently coregulated in their expression levels），请建立数学模型刻画基因表达的协同调节作用，并对模型的合理性进行评价；
（c）请建立模型，寻找与血管新生直接关联的基因。现有的方法是对表达显著性差异的基因利用 FDR校正以克服检验误差，但这样得到的基因数目通常还有数千个，请结合问题2模型，利用生物学功能基因组协同调节的特点减少敏感基因数目，并针对附件中数据在论文中给出50个最敏感基因。
问题a
针对附件数据建立基因表达差异的显著性检验模型，并进行相关参数估计，可以采用t检验或方差分析（ANOVA）等方法。对于小样本情况下提高显著性检验精度的方法，可以考虑以下几点：
- 引入重复测量：重复测量是指在相同条件下对同一样本进行多次测量，这可以增加样本数据量。通过对同一样本的多次测量，可以降低测量误差对显著性检验结果的影响。
- 使用配对设计：如果你有两组相关样本，例如治疗前后的数据或对照组与实验组的匹配样本，可以采用配对设计。在配对设计中，将两组相关的观测值进行配对，然后对配对差异进行显著性检验。配对设计可以减小样本间的变异，提高检验的精度。
- 选择适当的统计方法：针对小样本情况，可以选择非参数方法进行显著性检验，如Wilcoxon秩和检验或Mann-Whitney U检验。非参数方法不依赖于总体分布的假设，通常在小样本情况下更具有鲁棒性。
- 使用贝叶斯统计方法：贝叶斯统计方法可以在小样本情况下提供更准确的推断结果。贝叶斯方法基于先验知识和数据，给出后验概率分布，可以更好地估计参数，并提供概率结果。
- 采用交叉验证：如果你的数据集有限，可以使用交叉验证来评估模型的性能和稳定性。将数据集划分为训练集和测试集，使用训练集建立模型，然后在测试集上进行验证。通过多次交叉验证，可以获得更可靠的结果。
- 考虑使用引导法（bootstrap）：引导法是一种通过有放回抽样重采样生成新样本的方法。通过对原始数据的重采样，可以生成多个类似于原始数据分布的新样本集，从而进行参数估计和显著性检验。引导法能够在小样本情况下提供可靠的估计结果。
问题b
在研究基因表达的协同调节作用时，可以使用网络建模方法来刻画基因表达的相互关系。一个常用的数学模型是基因调控网络模型，其中基因被建模为节点，基因间的相互作用被建模为网络中的连接。这种模型可以捕捉基因之间的调控关系，从而揭示基因表达的协同调节作用。
基因调控网络模型可以使用图论和动力学系统理论来描述。下面给出一个简单的示例模型来说明：
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网络拓扑结构：基因调控网络可以用一个有向图来表示，其中每个基因对应一个节点。如果基因 A 调控基因 B 的表达，则在图中存在一条从节点 A 到节点 B 的有向边。这些边可以通过实验数据或生物学知识来确定。
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动力学方程：为了模拟基因表达的变化，可以使用动力学方程来描述每个基因节点的表达水平随时间的变化。一种常用的动力学模型是差分方程或微分方程，其中包括基因的自我调节和相互调节项。
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例如，可以使用基因表达水平的差分方程模型来表示：
ΔX_i(t) = f(X_i(t), θ_i) + ∑(w_ij * g(X_j(t), θ_j))
其中，X_i(t) 表示基因 i 在时间 t 的表达水平，f(X_i(t), θ_i) 表示基因 i 的自我调节项，∑(w_ij * g(X_j(t), θ_j)) 表示基因 i 受其他基因 j 调控的协同调节项，w_ij 是基因 i 对基因 j 的调控权重，θ_i 和 θ_j 是相关参数。
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参数估计与模型评价：参数估计可以通过拟合实验数据来进行，可以使用最小二乘法或最大似然估计等方法来估计模型参数。模型评价可以通过对模型拟合度、预测能力和稳定性进行验证，例如使用交叉验证、残差分析和灵敏度分析等方法。
模型的合理性评价可以考虑以下几个方面：
- 生物学合理性：模型中的基本假设和方程是否符合已知的生物学知识和实验观察结果？
- 数据拟合度：模型是否能够较好地拟合实验数据，预测基因表达的动态变化？
- 稳定性：模型是否对参数的变化或噪声的干扰具有一定的鲁棒性？
- 预测能力：模型是否能够合理地预测基因调控网络的行为，对新的实验条件下的基因表达变化进行预测？
问题c
为了寻找与血管新生直接关联的基因并减少敏感基因的数目，可以结合基因调控网络模型和表达显著性差异分析的方法。以下是一个基于该思路的流程：
- 数据预处理：对附件中的数据进行预处理，包括数据清洗、标准化、批次效应校正等步骤，确保数据的质量和一致性。
- 表达显著性差异分析：使用适当的差异分析方法（如t检验、方差分析等）对样本进行分组，比较不同组之间的基因表达水平差异。通过设定显著性阈值，筛选出在不同组之间具有显著差异的基因。
- FDR校正：对显著性差异的基因进行多重检验校正，例如使用Benjamini-Hochberg过程进行FDR（False Discovery Rate）校正。这可以控制多重假设检验的错误率，并筛选出在FDR校正后显著的基因。
- 基因调控网络建模：根据已知的基因调控关系或使用相关算法（如权重共享网络模型、因果推理方法等），建立基因调控网络模型。这个模型可以描述基因之间的协同调节作用，并识别出与血管新生直接关联的基因。
- 网络分析与筛选：在基因调控网络中，通过计算节点的中心性指标（如节点度、介数中心性等）来评估基因的重要性。选择具有较高中心性指标的基因，这些基因往往在调控网络中扮演重要角色，与血管新生直接关联的概率较大。
- 敏感基因筛选：结合步骤4和步骤5的结果，从显著差异基因中选择与血管新生直接关联且在基因调控网络中具有重要地位的基因。这些基因具有较高的生物学功能相关性和协同调节特点，可以作为敏感基因。