[Notas técnicas experimentais] Pontos de operação experimental de Western Blotting e análise de dados

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1. Preparação da Amostra

• ① Lise :
  ◆ Células : Descarte o sobrenadante da cultura , lave 1-2 vezes com PBS estéril (retire o meio residual da superfície das células e da placa de cultura, pois o soro do meio é rico em proteínas), adicione a célula lisado (placa de 80-100ul/60 mm) e inibidores de protease , agitar e lisar em um agitador e observar a qualquer momento. É melhor lisar no gelo (coloque uma caixa de gelo no shaker e coloque a placa de Petri na caixa de gelo).
  ◆ Tecido : Corte o bloco de tecido em um tamanho adequado , enxágue com PBS estéril 1-2 vezes, adicione lisado celular e inibidor de protease e homogeneize com um homogeneizador de alta velocidade (homogeneização a baixa temperatura: a parte externa do EP de fundo plano de 2 ml tubo com o bloco de tecido Coloque um pequeno béquer cheio de gelo moído) ou instrumento de trituração de tecido de alto rendimento para trituração (pré-resfrie o lisado com antecedência, divida o processo de trituração em várias seções, reduza o tempo de trituração de cada pequena seção e coloque o tubo EP contendo o tecido na abertura quebrada Enterre em gelo moído para esfriar por alguns minutos antes do próximo processo de trituração curta). O melhor craqueamento em baixa temperatura .
• ② Remova os detritos (após a lise total das células ou tecidos, haverá alguns detritos celulares que não podem ser completamente dissolvidos no lisado e precisam ser removidos): centrifugar a 12.000 rpm por 10-20 minutos a 4°C e retirar o sobrenadante. (Detritos celulares afundam no fundo do tubo após a centrifugação, e o sobrenadante é a proteína extraída)
• ③ Quantificação de proteína : O método BCA é usado para determinar a concentração de proteína e, em seguida, aliquotado.
• ④ Desnaturação de proteínas : adicione tampão de carregamento, ferva em água fervente por 5 minutos. (Banho de água fervente pode facilmente lavar a tampa do tubo EP. Para evitar contaminação, um banho de metal ou máquina de PCR também pode ser usado para desnaturar a proteína.)
• ⑤ Armazenamento : Aliquote e armazene amostras de proteína desnaturada a -20°C e armazenamento de longo prazo a -80°C. Ele também pode ser congelado a -80°C assim que a lise for concluída, e as amostras podem ser retiradas depois que as amostras forem reunidas para as etapas subsequentes, como desfragmentação, quantificação e desnaturação.
• Reagentes recomendados:
  △ 碧云天，Western 及 IP 细胞裂解液（P0013） Clivagem
  △ Pierce™ BCA Protein Assay Kit（23227） Determinação da concentração de proteína , recomendado para usar placa de 96 poços + leitor de microplacas, salvar reagentes (solução de trabalho BCA 200ul por poço), economizar problemas e tempo (digitalizar o leitor de microplacas, colar os dados no Excel, A concentração de cada proteína pode ser calculado, e o modelo pode ser salvo para o primeiro cálculo, e na próxima vez você pode preencher diretamente os dados no modelo para obter a concentração e o volume de cada tubo).
  Produção musical padrão BCA: (O funcionamento do manual oficial é mais complicado, vamos simplificar) A concentração do padrão BSA que acompanha o kit é de 2ug/ul, e o gradiente da curva padrão é definido: prepare 7 poços e adicione 20, 19, 18, 17, 16, 15 para cada poço em sequência, 14 ul de água deionizada, 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6 ul padrão BSA, então o ponto de proteína padrão obtido é 0, 2, 4, 6, 8, 10, 12 ug (pode abranger a faixa de extração de proteína lisada comum, concentração super alta de proteína não é aplicável).
  
  △ Sigma，Sample Buffer, Laemmli 2× Concentrate（S3401） A proteína é desnaturada , a proteína afunda bem, não é fácil flutuar e a amostra é carregada suavemente. Desvantagens: 2×, por isso é adequado apenas para amostras com alta concentração de proteína . Apenas a extração de proteína comum também pode usar o buffer de carregamento de Biyuntian (produtos domésticos).

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2. Preparação do gel SDS-PAGE e separação por eletroforese

2.1 Enchimento com cola

• ① Lavagem de placas de vidro : Existem diferentes especificações de placas de vidro, que podem preparar géis PAGE de diferentes espessuras . Deve-se tomar cuidado para selecionar placas de vidro adequadas para fazer cola . Enxágue com água ionizada várias vezes e deixe a peça de vidro encostar na cesta de arame para secar naturalmente , tomando cuidado para não ficar com manchas de água.
• ② Montagem da moldura de plástico : as placas de vidro devem ser emparelhadas (uma é uma placa grossa com ângulos retos de vidro , a outra é uma placa fina e lisa ), alinhe as placas de vidro emparelhadas e mantenha as bordas inferiores das duas placas de vidro na mesmo nível O suporte de colagem é fixo e depois instalado na estrutura de fixação. Preste atenção ao aperto (aperto) do suporte para fazer cola, a elasticidade (aperto) da mola no clipe na estrutura de fixação para fazer cola e se a tira de borracha na estrutura de fixação está limpa e tem boa resiliência . Sempre preste atenção se há vazamento ao derramar cola ,Se houver um pequeno vazamento , você pode prender uma ponta de pipeta de 1ml no suporte, conforme mostrado na foto acima, você pode apertar artificialmente o clipe no suporte. Se o vazamento for intenso , não há o que fazer, e o conjunto só pode ser montado novamente . entãoO melhor é combinar várias peças ao mesmo tempo , sempre tem uma que pode ser aproveitada。
• ③ Preparação da cola : O gel PAGE usado no western é descontínuo e dividido em duas camadas , a camada superior é o gel de empilhamento e a camada inferior é o gel de separação . Ao misturar, misture primeiro a camada inferior do gel de separação , de modo quePressione a cola com 500ul de etanol absoluto (melhor que a pressão da água), Após a solidificação do gel de separação, despeje o etanol absoluto e, após a volatilização do etanol, despeje água ionizada para limpar o etanol residual e, em seguida, combine a camada superior do gel de laminação. O gel de empilhamento precisa ter uma certa altura. Geralmente, a distância entre o fundo do poço da amostra e o gel de separação deve ser de 1 a 2 cm . Se a distância for muito curta, a pressão não será boa. Se a distância for muito longo, o gel de separação será curto, o que afetará a separação de proteínas.
• ④ Inserção do pente : Os pentes têm especificações diferentes , que são adequados para diferentes espessuras de cola e volumes de amostra, portanto, atenção deve ser dada. Insira o pente imediatamente após derramar a cola em camadas , e a ação deve ser rápida, caso contrário, o orifício da amostra será facilmente deformado. Ao inserir o pente, é melhor usar um pedaço de papel de palha grosso para bloqueá-lo, porque a acrilamida não solidificada é venenosa e é fácil borrifar o rosto ao inserir o pente, portanto, preste atenção à proteção . A poliacrilamida completamente polimerizada em gel é muito mais segura. Portanto, ao descartar a cola restante, você pode esperar que ela se solidifique completamente antes de descartá-la . Às vezes, quando o pente está desconectado e o espaço entre os orifícios da amostra é instável, deve ser que a ação de inserir o pente seja lenta.
• ⑤ Puxe o pente : Não puxe o pente com pressa depois que o gel de laminação estiver solidificado , mas remova o conjunto placa de vidro-cola-pente como um todo , coloque-o no tanque de eletroforese, despeje a solução eletroforética, e depois puxe-o para fora A solução eletroforética contém SDS, será mais suave ao retirar o pente.
• Fórmula de cola SDS-PAGE:
  △ O último na tabela X%é uma fórmula de cálculo geral , ajuste a quantidade de ddH ₂ O com a quantidade de 30% de acrilamida .
  △ 10% AP e TEMED são catalisadores que catalisam a polimerização da acrilamida ;. TEMED pode ser armazenado a 4°C por muito tempo
  

2.2 Separação eletroforética

• Princípio : A amostra será comprimida em uma linha fina em gel de empilhamento a 5% ^, que é o efeito dos íons glicinato Gly- e Cl- ^no tampão . No gel de empilhamento , o Cl- ^corre na frente, a amostra de proteína no meio e o íon Gly ^- sal na extremidade. Um gradiente de voltagem é formado entre ^Gly- e Cl- ^{para comprimir a amostra de proteína; quando atinge} o gel de separação , Gly ^- , Cl ^{- Correndo} na frente da proteína, a amostra de proteína sai do limite do gradiente de voltagem e começa a nadar em velocidades diferentes de acordo com o tamanho da proteína, separando-a assim de acordo com o tamanho da a proteína.
  
• Concentração de gel laminado : cerca de 5%, pH 6,8.
• Concentração do gel de separação : 7,5-15%, pH 8,8. Diferentes concentrações de géis de separação têm diferentes habilidades de separação para amostras de proteínas. Quanto menor a concentração , melhor a separação, mas pequenas proteínas são fáceis de escapar; 10-12% é comumente usado.
• Precauções para eletroforese:
  ① SDS-PAGE é sensível a íons. Use água deionizada para preparar a solução de eletroforese . O tanque de eletroforese e o recipiente com a solução de eletroforese também precisam ser enxaguados com água .
  ② Antes de carregar a amostra, lave o orifício da amostra com uma agulha de insulina . ③ Prepare a solução de eletroforese com um dia de antecedência, misture bem e coloque a 4 ° C. Na hora de usar, o tanque de eletroforese é ligeiramente inclinado e a solução de eletroforese é despejada lentamente ao longo da parede interna do tanque. É pode garantir que não haja bolhas de ar na borda inferior do gel PAGE . (O SDS está contido na solução de eletroforese. Se for preparado e usado imediatamente, a espuma produzida pelo SDS afetará a eletroforese, como acúmulo no fundo do gel PAGE, resultando em diferenças em cada faixa.) ④ Adicione lentamente a proteína amostras para os poços e o topo de cada poço É melhor manter o volume da amostra consistente. O poço sem proteína também é adicionado ao mesmo volume com tampão de carregamento, para que as bandas de proteína que saem possam ser mais uniformes, caso contrário as bandas de proteína irão flutuar para o poço pequeno ou vazio. Não se esqueça de colocar um marcador de proteína pré-corado no poço .
  
  

• Reagentes recomendados :
  △ 天能(produtos nacionais de alta qualidade), suporte para fabricação de gel SDS-PAGE, estrutura fixa para fabricação de gel, pente, placa de vidro
  △ Se você não deseja preparar a solução-mãe e a solução de eletroforese para o gel, é necessário é recomendado 迪生(a qualidade do produto é estável) SDS-PAGE stocking buffere TGS buffer.
  △ Marcadores de proteína pré-corados podem ser Thermo Scientificusados PageRuler™ Plus Prestained Protein Ladder, 10 to 250 kDa（26619）.

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3. Transfira o filme

• Existem dois tipos de transferência úmida e transferência semi-seca .
  Transferência úmida : mergulhe tudo em uma grande quantidade de solução de transferência. O sanduíche é inserido verticalmente no tanque de filme de transferência, do eletrodo negativo para o eletrodo positivo: almofada de esponja, papel de filtro, cola, membrana de PVDF , papel de filtro, almofada de esponja.
  Transferência semi-seca : Uma pequena quantidade de solução de transferência mantém o sanduíche úmido. O instrumento de transferência semi-seco é horizontal, com o pólo negativo na parte superior e o pólo positivo na parte inferior. Não há esponja e o papel de filtro está diretamente preso à placa do eletrodo. Do pólo positivo ao pólo negativo , a ordem é: placa de metal positiva, papel de filtro, membrana PVDF, cola, papel de filtro, placa de metal negativa, tampa de plástico.

• Fórmula de solução de transferência e fabricação de sanduíches para transferência úmida e semi-seca :
  

• recomendo:GE，PVDF 膜（A10074129）

• Notas para transferência de membrana:
  ① Recomenda-se usar membrana PVDF (alta eficiência de ligação de proteína), porque a eficiência da proteína de ligação à membrana NC é de cerca de 80-100ug/cm ² , enquanto a membrana PVDF pode atingir 155-300 ug/cm ² .
  ② Ao transferir a membrana, prepare 2 placas , a placa grande é despejada com a solução de transferência e a placa pequena é despejada com uma quantidade apropriada de metanol . Retire a cola da placa de vidro, corte a parte da cola laminada e mergulhe-a na solução de transferência.O papel de filtro com o mesmo tamanho da cola também é embebido na solução de transferência. Não se apresse em mergulhar a membrana de PVDF cortada em metanol, mas deixe-a flutuar suavemente na superfície do metanol líquido por 10s . Durante esses 10s, o metanol é suficiente para ativar a membrana de PVDF , e atenção deve ser dada à ativação de a membrana PVDF. Não podemos matá-la , então podemos começar a fazer sanduíches primeiro,Quando a membrana PVDF for adicionada, jogue a membrana em metanol para ativar, imediatamente carregado em sanduíches assim que ativado.
  ③ Ao fazer sanduíches, você precisa usar uma vareta de vidro ou um tubo de ensaio de vidro limpo e liso para eliminar as bolhas de ar entre a membrana e a cola .
  ④ As condições de transferência úmida geralmente são definidas às 22h 200mA 恒流，2.5-3h, o tempo é relativamente longo e a geração de calor precisa ser controlada , porque a geração de calor afetará o efeito de transferência do filme. É melhor preparar uma grande caixa de gelo cheia de gelo picado, adicionar um pouco de água e enterrar o tanque do filme de transferência na mistura de gelo e água para esfriar ; você também pode adicionar um rotor magnético ao tanque do filme de transferência e colocar o caixa de gelo e o tanque de filme de transferência em um magnético No agitador , mexa novamente e gire; ou coloque o tanque de transferência diretamente em um freezer de 4°C para esfriar .
  O tanque de filme de transferência da Bole está muito quente e precisa ser controlado; o tanque de filme de transferência da Pharmacia tem melhor controle de calor e pode não atingir nenhum calor.
  ⑤ O sanduíche semi-seco deve ser mantido úmido, mas a placa de metal ao redor do sanduíche deve ser mantida seca .
  ⑥ A condição para transferência semi-seca é usar 恒压 20V，20min-1h. Se a proteína for grande, o tempo de transferência pode ser estendido.
  ⑦ A transferência úmida pode transferir uma ampla gama de tamanhos de proteínas . A transferência semi-seca comum é adequada para a transferência de proteínas de tamanho 30-120KD. Algumas transferências semi-secas especialmente projetadas podem transferir proteínas de qualquer tamanho, assim como a transferência úmida. Isso depende da máquina específica.
  ⑧ Água deionizada também é necessária para a solução de transferênciaPara a preparação, o tanque de transferência e o recipiente precisam ser enxaguados com água deionizada,A fórmula da solução de transferência precisa ser ajustada de acordo com o tamanho da proteína, proteína grande ( >100 kD): SDS 1g, metanol 0 ml; proteína pequena ( <100kD): SDS 0g, metanol 200ml.
  ⑨ No processo de transferência de membrana, os efeitos do SDS e do metanol são exatamente opostos.
  · Depois que o SDS é combinado com a proteína, ele pode fazer com que a proteína seja transferida do gel mais facilmente , mas também pode impedir que a proteína se ligue à membrana , especialmente a ligação da proteína à membrana NC. Portanto, proteínas grandes não são fáceis de transferir e SDS adicionais devem ser adicionados; proteínas pequenas podem ser transferidas por SDS em gel PAGE. O excesso de SDS também afetará a corrente e aumentará o calor, afetando a antigenicidade de algumas proteínas. Portanto, é necessário controlar o conteúdo do SDS de acordo com a situação.
  · O metanol pode destruir a combinação de SDS e proteína e promover a combinação de proteína e membrana , mas reduzirá o tamanho dos poros do gel PAGE e fará com que algumas proteínas precipitem, afetando os resultados experimentais, portanto a quantidade deve ser rigorosamente controlada .

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4. Hibridização de anticorpos

• 1> Bloqueio : use 5%脱脂牛奶ou 5% BSA( TBSTdissolvido com) como solução de bloqueio , condições de bloqueio : 室温 1h，或 4℃过夜. (Depois que a proteína alvo é transferida para a membrana, mas existem muitas outras proteínas na membrana, porque a proteína total é usada para executar o gel, outras proteínas não alvo também serão transferidas para a membrana, o que exporá muitos anticorpos sítios de ligação, então A membrana precisa ser bloqueada antes da hibridização do anticorpo.)
  ◆ BSA : Geralmente é usado para a detecção de modificação de fosforilação de proteínas , porque o leite é rico em fosfatase, que mudará o estado de modificação de fosforilação de proteínas.
  ◆ Às vezes, a fórmula da solução de bloqueio e as condições de bloqueio precisam ser alteradas, especialmente para proteínas grandes, 5% de leite desnatado não é suficiente para bloquear por uma hora; algumas proteínas não podem ser usadas com leite e BSA, você pode usar gelatina para bloquear ou aplicar anticorpos diretamente sem bloquear.

• 2> Incubação do anticorpo primário : diluir o anticorpo primário com solução de bloqueio , durante a noite a 4°C, ou à temperatura ambiente ou 37°C por 1-X h.

• 3> Lavar a membrana com TBST , temperatura ambiente, 5min x 4 vezes.

• 4> Incubação do anticorpo secundário : 1h à temperatura ambiente.

• 5> Lave a membrana com TBST , temperatura ambiente, 5min × 8-12 vezes.

• 6> Desenvolvimento de cores ECL , prensagem de filmes de raios-X ou digitalização de filmes.

• Fórmula TBS : basta
  1L TBSadicionar . : Um detergente não iônico, que tem a função de redobrar o antígeno, o que pode melhorar a capacidade específica de reconhecimento dos anticorpos; melhorar o efeito de bloqueio e bloquear os locais não ligados na membrana com proteína inerte ou detergente não iônico, que pode reduzir o anticorpo Ligação não específica; não destrói a estrutura da proteína ao emulsificar a proteína.1ml Tween 20TBST
Tween 20
  

• Reagentes recomendados :
  Dickson ,. TBS(Um pacote de pó contém 500mL)
  GE , Amersham ECL Prime Western Blotting Detection Regent (RPN2232) são eficazes, mas caros, e Biyuntian tem um desempenho de custo mais alto.
  Substrato quimioluminescente Thermo, SuperSignal West Pico (34080).

5. Análise de imagem

• Use Gel-Pro Analyzer ou ImageJ (recomendado)
• Referência:
  Pesquisa científica básica para médicos - 13. Processamento de resultados WB (recomendado para ler isto)
  [Notas de estudo de tecnologia experimental] Análise de banda Western Blot｜Image J e banda Graphpad análise em escala de cinza e processo de processamento
  Inventário de experiência de Western blot, aqui está Um artigo é suficiente
  para medir imagens eletroforéticas com Gel-Pro de nível profissional

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6. Análise de problemas comuns

1) Bandas não específicas:

• A concentração de anticorpos é muito alta: ◆ Diminua a concentração de anticorpos
• Bloqueio insuficiente:
  ◆ Aumente a concentração da solução de bloqueio, por exemplo, de 5% para 7%
  ◆ Aumente o tempo e/ou a temperatura do bloqueio
  ◆ Adicione 0,05% de Tween 20 à solução tampão de bloqueio
  ◆ Use a mesma solução de bloqueio para a diluição do anticorpo
• SDS causa ligação não específica de anticorpos e bandas de proteína:
  ◆ Lave o blot após a transferência.
  ◆ Não use SDS durante o imunoensaio.
• Qualidade do anticorpo: experimente diferentes anticorpos

2) Fraco ou sem bandas

• Problemas de anticorpos, baixa atividade ou baixa concentração, anticorpo primário de baixa afinidade, anticorpos primários e secundários incompatíveis:
  ◆ Aumente a concentração de anticorpos
  ◆ O anticorpo pode ter perdido atividade, execute dot blot para determinar sua atividade e concentração ideal
  ◆ Os testes são diferentes Anticorpo e/ou primário -combinação secundária
• Reatividade antígeno-anticorpo insuficiente:
  ◆ Aumente a carga total de proteína por amostra no gel
  ◆ Verifique a integridade da amostra para garantir que a proteína não seja degradada
• Antígeno bloqueado pela solução de bloqueio
  ◆ Tente uma solução de bloqueio diferente (por exemplo, evite leite ao detectar proteínas fosforiladas)
  ◆ Otimize a concentração da solução de bloqueio, 3–5% de BSA ou leite em pó desnatado é recomendado
• Baixo desempenho do substrato quimioluminescente
  ◆ Aumente o tempo de incubação do substrato
  ◆ Prepare uma pequena quantidade de solução de trabalho para determinar se o substrato perdeu atividade. Em uma sala escura, adicione uma pequena quantidade de conjugado HPR à solução de trabalho do substrato e a luz azul deve aparecer. Caso contrário, o substrato ou conjugado HRP deve estar inativo.
  ◆ Certifique-se de que não haja contaminação cruzada entre os dois frascos do kit de substrato. Se ocorrer contaminação cruzada entre os dois reagentes, a atividade dos reagentes diminuirá.
  ◆ Azida é um inibidor de HRP, não use azida no tampão de anticorpo secundário
• Remoção de anticorpos e rehibridização no blot
  Otimize as condições de remoção de anticorpos
  Realize a detecção de rehibridização somente quando necessário
  Evite a rehibridização repetida do mesmo blot
• Transferência insuficiente
  ◆ O tempo de transferência é muito curto. Se a transferência úmida for usada, é necessário aumentar o tempo de transferência. ◆
  O campo elétrico de transferência é muito fraco. Aumente a tensão ou corrente de transferência.
  ◆ A solução de transferência não é otimizada. Adicionar 0,01- 0,05% SDS
  ◆ Reduza a concentração de metanol no tampão de transferência para 5% ou menos.
  ◆ A seleção do gel não é apropriada, use uma porcentagem menor de gel de poliacrilamida
  ◆ Use solução de coloração vermelho ponceau para tingir a membrana e solução de coloração azul brilhante Coomassie para tingir o gel após a transferência para confirmar a eficiência da transferência e otimizar a transferência com base nisso Condição da membrana.
• Transferido
  ◆ O tempo de transferência é muito longo, reduza o tempo
  ◆ O campo elétrico de transferência é muito forte, reduza a tensão ou corrente de transferência
  ◆ A solução de transferência não está otimizada, equilibre o gel na solução de transferência por 20 minutos antes de montar o “sanduíche” para reduzir Aumente o tempo concentração de SDS no gel para evitar a transferência excessiva de proteínas de baixo peso molecular.
  ◆ Aumente a concentração de metanol no tampão de transferência para 40%
  ◆ Seleção de gel inadequada, use géis de acrilamida com maior porcentagem
  ◆ Use géis de Tris/tricina quando o peso molecular da proteína alvo for inferior a 10 KD. Use uma membrana de 0,2 µm para resolver o excesso de transferência de pequenas proteínas.
  ◆ Pequenas proteínas passarão pela membrana de transferência de poros grandes, e uma membrana de 0,2 μm é sobreposta à membrana de 0,45 μm para detectar a transferência excessiva de pequenas proteínas

3) O sinal está supersaturado

• Bandas ocas:
  ◆ O volume de carga é muito alto, reduz a carga total de proteína por amostra
  ◆ Muitos anticorpos, reduz a concentração de anticorpo primário e/ou anticorpo secundário
  ◆ O substrato quimioluminescente é muito sensível, substitua por produtos químicos menos sensíveis Substrato luminescente
• As bandas são tão densas que ficam juntas:
  ◆ Carregue muita amostra, reduza a carga total de proteína por amostra
  ◆ Muitos anticorpos, reduza a concentração de anticorpos primários e/ou secundários

4) Bolhas na tira:

• Montagem inadequada do sanduíche
  ◆ Use mais tampão de transferência ao montar o “sanduíche”
  ◆ Estenda todas as bolhas de ar entre o gel e a membrana ao montar o “sanduíche”
  ◆ Use Ponceau antes da incubação do anticorpo Manche a membrana com solução de corante para verificar a qualidade do membrana de transferência.

5) Transferência de filme irregular:

• Secagem parcial ou hidratação desigual do blot
  Certifique-se de que todo o blot esteja uniformemente submerso e equilibrado no tampão de transferência
  As membranas de PVDF precisam ser pré-molhadas e equilibradas com 100% de metanol antes de serem colocadas no tampão
• Problemas de hardware
  ◆ Verifique as conexões da fiação da unidade de transferência úmida
  ◆ Certifique-se de que a placa de metal esteja limpa e livre de danos físicos, mesmo uma leve dobra da placa de metal pode alterar drasticamente a intensidade do campo elétrico de um sistema de transferência semi-seco
  O uniforme elétrico campo do instrumento de filme tem conteúdo técnico, então o dinheiro para comprar um instrumento de transferência de filme não pode ser economizado)

6) O fundo é muito forte:

• Concentração de anticorpo primário e/ou secundário muito alta: diluir a concentração de anticorpo primário e/ou secundário
• Bloqueio insuficiente
  ◆ Aumente a concentração do tampão de bloqueio, por exemplo, 3–5% de soro de albumina bovina, caseína, leite desnatado
  ◆ Diminua o tempo e/ou a temperatura do bloqueio
  ◆ Adicione 0,05% de Tween-20 ao tampão de bloqueio
  ◆ Use o mesmo diluente de anticorpo Solução de bloqueio (adicione 0,05% Tween-20)
• Solução de bloqueio incorreta usada, anticorpo primário e/ou secundário ligado à proteína no tampão de bloqueio: tente outra solução de bloqueio (albumina, caseína, leite desnatado, etc.). Não use leite para bloquear borrões ao usar o sistema avidina-biotina - o leite contém biotina
• Lavagens insuficientes
  ◆ Aumente o número de lavagens e o volume do tampão (mínimo 5 × 5 minutos)
  ◆ Se o tampão de lavagem não contiver
• O tempo de exposição é muito longo: reduza o tempo de exposição da imagem
• O borrão seca durante o borrão
  Certifique-se de que o borrão permaneça úmido
  Certifique-se de que o borrão seja mantido coberto com líquido suficiente para evitar que seque
• A reutilização do buffer leva à contaminação: use buffer novo

7) O fundo está manchado

• Parte do borrão seca
  Certifique-se de que o borrão permaneça úmido
  Certifique-se de que o borrão seja mantido coberto com líquido suficiente para evitar que seque
• Contato insuficiente do tampão de lavagem com algumas áreas do blot
  Aumente o volume do tampão de lavagem
  Evite empilhar muitos blots em um recipiente de incubação
• Contato insuficiente do tampão de lavagem com algumas áreas do borrão: use um "sanduíche" de transferência limpo ou novo
• Contaminação do borrão
  ◆ Não toque no borrão diretamente com as mãos. Use sempre luvas de limpeza ou pinças médicas
  Certifique-se de que o equipamento de eletroforese, o equipamento de transferência e as placas de incubação estejam limpos e longe de fontes externas de contaminação

8) O fundo é salpicado

• Fragmentos de gel aderem à membrana de absorção: remova os fragmentos de gel de acrilamida que permanecem na superfície da membrana de absorção
• Agente de bloqueio grumoso adere ao blot
  ◆ Certifique-se de que o agente de bloqueio esteja completamente dissolvido antes de usar
  ◆ Adicione 0,1% de Tween-20 à solução tampão de bloqueio
• Agregação de anticorpo
  ◆ Use filtro de 0,2 μm para filtrar a solução tampão de anticorpo
  ◆ Use anticorpo fresco
  ◆ Adicione 0,1% de Tween-20 à solução tampão de anticorpo
• Contaminação do tampão
  ◆ Use um novo tampão
  ◆ Tampão do filtro com filtro de 0,2 μm

9) O conteúdo da proteína de referência interna é inconsistente entre diferentes amostras

• Durante o experimento, o nível de expressão da proteína doméstica selecionada como referência interna muda
  . Identifique e verifique a consistência da proteína de referência interna selecionada nas condições experimentais, o que significa que as condições experimentais atuais não alterarão o nível de expressão da proteína interna proteína de referência. Use um corante para
  fornecer A proteína total na membrana foi corada e a proteína total detectada na membrana foi usada como referência interna

10) Saturação do sinal de detecção de proteína de referência interna

• Durante o experimento, o nível de expressão da proteína doméstica selecionada como controle interno muda
  . Reduza o volume da amostra para eliminar a saturação do sinal
  . Dilua a concentração de anticorpo ou reduza o tempo de incubação para evitar a saturação do sinal de detecção
  . Selecione outra proteína de baixa abundância com consistente expressão como referência interna
  Corar a proteína total na membrana com um corante e usar a proteína total detectada na membrana como referência interna