1. Q: Le test rh Annexin V R-PE 20 est un kit utilisé par BD pour la détection cytométrique de l'apoptose en flux. Le produit montre que l'espèce est humaine. Peut-il être utilisé pour la détection de cellules de rat?
R: Oui. Parce que l'Annexine V est compatible avec le PS, et le PS ne devrait avoir aucune différence entre les différentes espèces. Dans les cellules normales, la phosphatidylsérine (PS) n'est distribuée qu'à l'intérieur de la bicouche lipidique de la membrane cellulaire.Au stade précoce de l'apoptose, la phosphatidylsérine (PS) dans la membrane cellulaire tourne de l'intérieur de la membrane lipidique vers l'extérieur. L'annexine V est une protéine de liaison aux phospholipides dépendante du Ca2 + avec un poids moléculaire de 35 ~ 36 kD. Elle a une forte affinité pour la phosphatidylsérine, de sorte qu'elle peut se lier à la membrane cellulaire des cellules d'apoptose précoce grâce à la phosphatidylsérine exposée à l'extérieur de la cellule. Par conséquent, l'Annexine V est utilisée comme l'un des indicateurs sensibles pour détecter l'apoptose cellulaire précoce. L'annexine V est marquée à la fluorescéine (FITC), et l'Annexine V marquée est utilisée comme sonde fluorescente, et l'apparition de l'apoptose cellulaire peut être détectée par un microscope à fluorescence ou un cytomètre en flux.
2. Q: Pourquoi y a-t-il une si grande différence entre l'utilisation de la cytométrie en flux pour l'apoptose cellulaire et Tunel? ? Le taux d'apoptose mesuré par tunnel est d'environ 30%, tandis que le taux d'apoptose mesuré par cytométrie en flux n'est que de 2% (0,5% pour le contrôle négatif). La différence est énorme. Le kit de double coloration Annexin V / PI de Beckman est utilisé. , Les étapes expérimentales sont les suivantes:
(1) La trypsine digère les cellules adhérentes, ajouter du milieu de culture pour arrêter, centrifuger à 1000 rpm pendant 5 min
(2) Aspirez le surnageant et remettez les cellules en suspension dans 0,5 ml de PBS (car elles doivent être envoyées à d'autres endroits pour la cytométrie en flux, le trajet dure environ 1 heure et la température extérieure est d'environ 37 degrés)
(3) Ensuite, ajoutez 5 μl chacun d'Annexine V / PI, protégez de la lumière pendant 20 minutes, et allez sur la machine.
Puis-je demander ce qui cause cela?
R: J'ai également utilisé ces deux méthodes pour faire de l'apoptose.La différence de taux d'apoptose mesurée par les deux méthodes est un peu grande, mais elle n'est pas aussi grande que la vôtre. La double coloration mesure l'éversion PS, un événement précoce d'apoptose. TUNEL mesure la fragmentation de l'ADN au stade le plus avancé de l'apoptose. De plus, TUNEL traite les cellules endommagées et les cellules nécrotiques comme des cellules apoptotiques pendant le processus de détection, et si TUNEL est compté à l'œil nu, il y aura des erreurs de jugement. Par conséquent, TUNEL produit souvent un taux d'apoptose plus élevé. Mais si le taux d'apoptose atteint 30%, l'échelle estime qu'il devrait également s'épuiser. Bien que la double teinture soit une opération de la machine, l'influence humaine est assez évidente lors du débogage et de la compensation, et elle n'est pas particulièrement objective. Si la ligne de base est légèrement décalée vers la gauche, votre taux d'apoptose augmentera de façon exponentielle. Par conséquent, nous vous suggérons de le faire encore quelques fois dans les limites du budget et du temps. Ressentant une si grande différence, il peut y avoir des problèmes avec ces deux méthodes. En outre, sur le chemin de l'écoulement, le tube ep contenant les cellules est mieux inséré sur la glace et tenant la glacière.
3. Q: Puis-je utiliser de l'azote liquide pour stocker les tissus tumoraux, puis effectuer une analyse par cytométrie en flux?
R: Je pense que c'est impossible. Parce que la cytométrie en flux nécessite que les cellules soient dispersées, uniques et viables, afin de distinguer les cellules mortes, apoptotiques et viables. Pendant le processus de congélation et de réchauffement du tissu, un grand nombre de morts cellulaires se produira. En même temps, le tissu après ce processus formera beaucoup de débris cellulaires lorsqu'il sera séparé en cellules individuelles. Il ne convient pas à l'écoulement Il est donc préférable que les échantillons soient des échantillons frais, c'est-à-dire qu'ils doivent être testés immédiatement après le prélèvement des matériaux, et l'effet est le meilleur.
J'ai également essayé de stocker le tissu à -80 ° C avant d'effectuer la cytométrie en flux.Le résultat était que les cellules tissulaires traitées par la suite étaient soit du mucus, soit cassées, ce qui était impossible à détecter du tout. Si vous ne trouvez vraiment pas de cytomètre en flux qui puisse être détecté, je suggère que vous puissiez trancher l'échantillon de tissu, puis faire une coloration in situ pour observer l'apoptose des cellules tissulaires.
Une partie du bloc de tissu tumoral dans notre laboratoire est congelée dans de l'azote liquide pour une extraction ultérieure des protéines pour l'extraction occidentale ou de l'ARN pour la RT-PCR, et l'autre partie est fixée avec du formaldéhyde à 10% pour une immunohistochimie ultérieure.
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La source: 51xxziyuan.com