[Academia China de Ciencias] Biología Molecular - Zhu Yuxian Cuarta Edición - Notas - Biología Molecular de Virus

Biología Molecular de Virus

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12. Biología molecular de virus (Capítulo 9 del libro de texto)

12.1 Conceptos básicos de los virus

● Conceptos relacionados con las enfermedades infecciosas

• Patógeno : Un organismo que causa enfermedad en el cuerpo humano.
• Las bacterias y los virus son los patógenos más conocidos.
• Los hongos, protozoos y parásitos también causan enfermedades: tinea corporis, malaria, angiostrongiliasis, cantoniasis, etc.
• Enfermedad infecciosa: Patógenos que pueden transmitirse de una persona a otra

● Patógenos microbianos comunes

El concepto y características de los virus.

• Los virus son una clase de microorganismos que no tienen una estructura celular y están compuestos de ácidos nucleicos y proteínas que son heredados y replicados por las células huésped.
• Características :
  (1) Partículas a nanoescala , que solo pueden observarse con un microscopio electrónico;
  (2) Sin estructura celular , sus componentes principales son solo ácido nucleico y proteína;
  (3) Cada virus contiene solo un ácido nucleico , ya sea ADN o ARN; Tamaño del genoma: 3 kb - 1,2 Mb
  (4) El virus no puede replicarse de forma independiente
  y solo puede sintetizar sus propios componentes de ácido nucleico y proteína mediante el uso del sistema metabólico existente en la célula viva huésped;
  (6) En condiciones in vitro, puede existen en el estado de macromoléculas biológicas no vivas y mantienen su actividad infectiva durante mucho tiempo; (7
  ) No es sensible a los antibióticos generales, pero es sensible al interferón ;
  (8) Algunos virus Los ácidos nucleicos también pueden integrarse en el genoma del huésped e inducir la infección latente .
  

Clasificación y morfología de los virus

● Clasificación de virus

• Clasificación a partir del material genético : virus de ADN, virus de ARN, virus proteicos (p. ej.: priones)
• Clasificación de la estructura del virus : virus verdadero (Euvirus, virus para abreviar) y subvirus (Subvirus, incluidos viroide, pseudovirus, prión)
• Clasificación por tipo de huésped : bacteriófago (virus bacteriano), virus de plantas (como el virus del mosaico del tabaco), virus animal (como el virus de la influenza aviar, el virus de la viruela, el VIH, etc.)
• Dividido por naturaleza : virus leve (VIH), virus grave (virus de la rabia).

Morfología del virus
(1) esferovirus; (2) baculovirus; (3) virus ladrillo; (4) coronavirus; (5) filovirus; (6) estreptovirus; (7) virus envueltos (8) con cabeza esférica; (9) virus de
insectos encerrados en cuerpos de inclusión.

La estructura de un virus.

(1) Estructura básica del virus

• Partícula de virus ( virus particle): se refiere específicamente a un virus único maduro, estructuralmente completo e infeccioso, compuesto principalmente de material genético interno y cubierta proteica.
• En su centro está el ácido nucleico, llamado núcleo ( core) o genoma, y ​​las proteínas rodean el núcleo, formando la cápside ( capsid). El núcleo y la cápside se denominan colectivamente capa del núcleo ( nucleocapsid).
• Funciones de la cápside : ① antigénico; ② proteger el ácido nucleico; ③ mediar en la combinación de virus y células huésped.

(2) Estructura auxiliar del virus

• Algunos virus más complejos (generalmente virus animales, como los virus de la influenza) tienen una estructura de membrana de bicapa de lipoproteínas fuera de la nucleocápside viral, que se obtiene cuando el virus se libera por gemación y atraviesa la membrana de la célula huésped o membrana nuclear, llamada envoltura . En la superficie de la envoltura hay glicoproteínas codificadas por virus incrustadas en protuberancias en forma de púas llamadas púas . Los virus envueltos son sensibles a los solventes orgánicos .
• Función envolvente : ① Proteger la nucleocápside: ② Promover la adsorción de virus y células huésped: ③ Antigénico.

● Generalmente simétrico : solo hay dos sistemas simétricos de partículas de virus, a saber, simetría helicoidal (que representa el virus del mosaico del tabaco) y simetría icosaédrica (simetría de eje igual, que representa adenovirus). Algunos virus con estructuras más complejas son esencialmente el resultado de la combinación de las dos simetrías anteriores, por lo que se denominan simetría compuesta (que representa el fago T con número par)

12.2 Virus comunes y enfermedades relacionadas

Introducción a los virus comunes y enfermedades relacionadas

• 天花Es una enfermedad infecciosa grave causada por el virus de la viruela.Después de que el paciente se recupere, habrá marcas de viruela en la cara, por lo que "viruela" obtuvo su nombre. El virus de la viruela se reproduce rápidamente y se propaga por el aire a una velocidad asombrosa. Hasta que se elimine la cicatriz del paciente, la viruela aún puede transmitirse del paciente a otras personas. Algunos historiadores dijeron una vez que el mayor genocidio en la historia humana no se logró con armas, sino con viruela. Gracias a la aplicación y popularización de la vacuna vaccinia, la viruela se convirtió en la primera enfermedad infecciosa humana en ser completamente erradicada, lo que se puede decir que es el logro culmen del ser humano en la lucha contra las enfermedades infecciosas .

• 流行性感冒(Influenza para abreviar) es una infección respiratoria aguda altamente contagiosa y de rápida propagación causada por el virus de la influenza , principalmente a través de gotitas en el aire, contacto entre personas o contacto con elementos contaminados.
  Los síntomas clínicos típicos incluyen principalmente : inicio repentino de fiebre alta, dolor general, fatiga significativa y síntomas respiratorios leves. Generalmente, el otoño y el invierno son la época de mayor incidencia, y las complicaciones y muertes que provoca son muy graves.
  Los virus de la influenza reciben su nombre por la estructura de su superficie (la espiga) . Por ejemplo , H5N1 , H significa hemaglutinina , su función es permitir que el virus se una a la célula huésped ; N significa neuraminidasa , su función es liberar el virus que se ha replicado de la célula . En la influenza A, H se puede dividir en 16 subtipos y N se puede dividir en 9 subtipos. Todos estos subtipos han sido aislados de aves.

• 埃博拉病毒Descubierto por primera vez en el área del río Ébola en el sur de Sudán y el Congo en 1976, es un virus de enfermedad infecciosa grave que puede causar fiebre hemorrágica del Ébola en humanos y otros primates. El mundo actual , con una tasa de mortalidad entre el 50% y el 90% , mató a 11.000 personas en África entre 2014 y 2016. En la actualidad, se ha aprobado el uso de la vacuna contra el ébola, lo que brinda esperanza para superar el ébola.

• 艾滋病毒También conocido como virus de inmunodeficiencia humana ( VIH ), fue informado por primera vez por los Centros para el Control y la Prevención de Enfermedades de EE. UU. el 5 de junio de 1981. Ataca principalmente a los linfocitos T del cuerpo humano, provocando una disfunción del sistema inmunitario , y los pacientes suelen morir a causa de infecciones o tumores malignos de otros patógenos comunes . Aunque generalmente se reconoce que la "terapia de cóctel" puede controlar eficazmente la progresión del SIDA, hasta ahora, el SIDA sigue siendo uno de los problemas médicos más difíciles.

• 冠状病毒En términos de clasificación sistemática, pertenece al orden de Nestoviridae-Coronaviridae-Coronaviridae, y es una gran clase de virus de ARN que existen ampliamente en la naturaleza . El nuevo coronavirus de 2019 (2019-nCoV) es el séptimo coronavirus conocido que puede infectar a los humanos, y los otros seis son HCoV-229E, HCoV-OC43, HCoV-NL63, HCoV-HKU1 y SARS-CoV Síndrome respiratorio agudo severo) y MERS-CoV (causante del Síndrome Respiratorio de Oriente Medio).

retrovirales

● Descubrimiento de retrovirus

• El RSV (virus del sarcófago de Rou) fue descubierto en 1910 por Peyton Rous. Peyton Laws extrajo sustancias de tumores de pollo y las inyectó en pollos sanos de Plymouth Rock, y descubrió que los extractos de tumores podían inducir la tumorigénesis.
• Peyton Rous recibió el Premio Nobel de Fisiología o Medicina en 1966.
  

El genoma de un retrovirus.

• El retrovirus adquiere el oncogén src (El virus no tiene src originalmente, y el src se obtiene después de infectar al host）。
  

Tres conceptos relacionados con el cáncer

• 癌基因 (oncogene)Codifica una proteína de señalización defectuosa . Al dar continuamente a las células la señal para dividirse, hacen que se formen tumores.Los oncogenes son genéticamente dominantes _, posiblemente codificando factores de crecimiento defectuosos , receptores, proteínas G, proteínas quinasas o reguladores nucleares de la transcripción.
  ◆ Proteínas codificadas por oncogenes :
  

• 抑癌基因 (Tumor suppressor gene)Codifica proteínas reguladoras que inhiben la división celular, reparan errores de ADN o regulan la apoptosis . Cuando los genes supresores de tumores no funcionan correctamente, las células pueden crecer sin control, lo que puede provocar cáncer. Las mutaciones en estos genes tienenGenéticamente recesivo , pero puede conducir a la formación de tumores..
  ◆ Genes supresores de tumores comunes:
  

• 原癌基因（细胞转化基因） Proto-oncogene ; Cellular oncogene, C-onc
  Existe en el genoma celular, se encuentra en un estado de expresión estático o de bajo nivel (restringido) en circunstancias normales, y juega un papel importante en el mantenimiento de la función normal de las células. Cuando es activado por factores cancerígenos, conducirá a malignidad transformación de las células.

● Generación de oncogenes a partir de protooncogenes correspondientes:

• mutación puntual
• Translocación cromosómica, en la que dos genes se fusionan para producir un gen híbrido que codifica una proteína quimérica cuya actividad difiere de la de la proteína parental.
• Una translocación cromosómica que coloca un gen regulador del crecimiento bajo el control de otro promotor , lo que resulta en una expresión anormal de ese gen.
• Amplificación y replicación anormales de un segmento de ADN que contiene un protooncogén , lo que da como resultado una sobreproducción de la proteína codificada

Transformación de protooncogenes a oncogenes virales

1. La espiga del retrovirus se une al receptor en la superficie de la membrana de la célula huésped, se produce endocitosis y el ARN viral ingresa a la célula huésped.
2. El genoma del ARN retroviral se transcribe de forma inversa en ADN de doble cadena y se integra en la célula huésped junto al protooncogén.
3. Una vez que el protooncogén se integra en el genoma viral, se empaqueta para formar un nuevo virus y el virus se libera después de una gran cantidad de amplificación en la célula huésped.
4. El nuevo virus continúa infectando otras células huésped, y el protooncogén puede mutar a un oncogén que provoca la transformación maligna de la célula huésped durante el proceso de infección; incluso si no muta, la expresión del protooncogén aumentará de manera anormal .
   

12.2.1 VIH VIH 2× (+)ssRNA

VIH

• El VIH es el virus de la inmunodeficiencia humana. Es este virus el que causa el síndrome de inmunodeficiencia adquirida o SIDA.
• El VIH infecta principalmente células importantes en el sistema inmunitario humano, como las células T auxiliares (específicamente las células T CD4+ ), los macrófagos y las células dendríticas .
• El SIDA es la etapa avanzada de la infección por VIH en la que el sistema inmunitario de una persona está tan dañado que tiene dificultad para combatir enfermedades y ciertos tipos de cáncer.
• Actualmente, no existe una cura para la infección por VIH.
• El VIH es un retrovirus cuyo genoma de ARN se transcribe inversamente en ADN de doble cadena y se integra en el ADN de la célula huésped.
• La partícula central del VIH contiene dos copias de su genoma de ARN , cada una unida con un cebador (ARNt del huésped) y transcriptasa inversa (RT). La partícula central está rodeada por una envoltura que contiene la proteína de punta.
• Las proteínas accesorias regulan la formación y latencia del virión .
• Las secuencias retrovirales antiguas están presentes en los genomas animales, incluidos los genomas humanos.

Genoma y estructura del VIH

• El VIH consta de dos copias 正链(se puede traducir directamente) compuesto por ARN monocatenario , que codifica nueve genes del virus (Pero hay más de 9 proteínas expresadas , por ejemplo, la proteína expresada por el gen gag se dividirá en p17, p24, p7), y está rodeado por una cápside cónica que consta de 2.000 copias de la proteína viral .p24Caspid
• El ARN monocatenario se une estrechamente a y es necesario para el desarrollo del virión 核衣壳蛋白, como la transcriptasa inversa, la proteasa, la ribonucleasa y la integrasa.p7酶
• Una matrizp17 compuesta de proteínas virales rodea la cápside y asegura la integridad de la partícula del virión .
• Envoltura viral : dos capas de moléculas grasas (fosfolípidos) extraídas de células humanas
• EnvCodifica una tapa trimérica (3 glicoproteínas gp120) y un tallo trimérico (3 gp41), que juntos gp160forman la espiga .
• El genoma de ARN consta de al menos 7 marcadores estructurales (LTR, TAR, RRE, PE, SLIP, CRS e INS) y 9 genes (gag, pol y env, tat, rev, nef, vif, vpr, vpu; a veces un décimo Un gen tev, que es una fusión de tat, env y rev), codifica 19 proteínas .
• gagy contienen la información necesaria para fabricar las proteínas estructuralespol de las nuevas partículas virales.env

ciclo de vida del VIH

1. Después de la fusión del VIH con la membrana de la célula huésped , los viriones del VIH se liberan en el citoplasma.
2. El genoma del VIH se transcribe inversamente en ADN de doble cadena y se integra en el genoma del huésped.
3. El ADN se transcribe proviralmente en ARNm retroviral y se exporta al citoplasma para su traducción .
4. El ARN retroviral y las proteínas se ensamblan en la membrana celular y se fusionan con la célula, liberando el virus fuera de la célula.
   

★Pasos clave en el ciclo de vida del VIH-1

(1) Entrar en la celda

• ① El VIH se adsorbe en los receptores de las células objetivo a través de las glicoproteínas de superficie de los macrófagos y las células T CD4+, luego la envoltura viral se fusiona con la membrana celular y libera la cápside del VIH en las células, ingresando así a los macrófagos y las células T CD4+;
• ② El proceso de ingreso a la célula se inicia por la interacción entre el complejo de envoltura trimérica ( gp160 spike, pico ) y CD4los receptores de quimiocinas (generalmente CCR5o , u otras interacciones). El pico de Gp160 contiene dominios de unión para CD4 y receptores de quimiocinas.CXCR4
• ③Combinado gp120con la integrina α4β7 para activar (vía de señalización descendente), que es la principal integrina involucrada en el establecimiento de sinapsis virales, que pueden promover la propagación efectivaLFA-1 del VIH-1 entre las células .
• ④ Después de que el VIH se una a las células objetivo, inyecte el ARN del VIH y varias enzimas (incluidas la transcriptasa inversa, la integrasa, la ribonucleasa y la proteasa) en las células .
• ⑤ El VIH puede infectar las células dendríticas (DC) a través de la vía CD4-CCR5 o la vía del receptor de lectina de tipo C específico de manosa (como DC-SIGN). Las DC son una de las primeras células con las que se encuentra el virus durante la transmisión sexual. Se cree que las DC juegan un papel importante al transmitir el VIH a las células T mientras capturan el virus en la mucosa.

(2) Transcripción inversa del genoma del VIH en ADN de doble cadena

• ① Poco después de que la cápside viral ingrese a la célula, la transcriptasa inversa libera el genoma de ARN monocatenario (+) de la proteína viral adjunta y lo copia en una molécula de ADN complementaria (ADNc).
• ②El proceso de transcripción inversa es muy propenso a errores (porque la transcriptasa inversa tiene baja fidelidad) y produce mutaciones que podrían generar resistencia a los medicamentos o permitir que el virus evada el sistema inmunitario del cuerpo .
• ③ La transcriptasa inversa también tiene actividad de ribonucleasa , que puede degradar el ARN viral durante la síntesis de ADNc ; también tiene actividad de polimerasa de ADN dependiente de ADN , que se utiliza para generar ADN sentido a partir de ADNc antisentido .
• ④ El ADNc y su secuencia complementaria juntos forman el ADN de doble cadena del virus , que luego se transporta al núcleo a lo largo de los microtúbulos . El ADN viral se integra en el genoma de la célula huésped por la integrasa viral.

● Proceso de transcripción inversa

• ① 特定的细胞 tRNAActuar como cebador y unirse al sitio de unión del cebadorPBS del genoma viral ;
• ② Sintetizar ADN complementario y unirse a la región R (repetida en ambos extremos de la molécula de ARN) y U5 (región no codificante) del ARN viral;
• ③ El dominio llamado ARNasa H en la transcriptasa inversa puede degradar el ARN 5'末端, por lo tantoEliminar regiones R y U5；
• ④ Luego, el cebador "salta" al genoma viral3'端 , donde la hebra de ADN recién sintetizada se hibrida con la región R complementaria en el ARN ;
• ⑤ La primera hebra de ADN complementario (ADNc) se extiende ,La mayor parte del ARN viral es degradado por la ARNasa H；
• ⑥ Una vez completada la hebra, comience la síntesis de la segunda hebra a partir del ARN viral ;
• ⑦ Luego hay otro " salto " en el que el PBS de la segunda hebra se hibrida con el PBS complementario de la primera hebra ;
• ⑧ Ambas cadenas se extienden aún más y pueden integrarse en el genoma del huésped mediante la integrasa.
  

(3) Replicación y transcripción

• ① Este ADN viral integrado puede permanecer inactivo durante el período de latencia de la infección por VIH . Para producir activamente el virus, ciertos factores de transcripción celular deben estar presentes , el más importante de los cuales es NF-κB ( ).NFκBCuando las células T se activan (como ocurren otras infecciones), se secretan NFκBy el virus comienza a replicarse. Esto significa que las células que tienen más probabilidades de ser destruidas por el VIH son aquellas que actualmente están luchando contra la infección .
• ② Durante la replicación del virus , el provirus de ADN integrado se transcribe en ARNm , el ARNm se corta en fragmentos más pequeños , estos pequeños fragmentos se exportan desde el núcleo al citoplasma y luego se traducen en proteínas reguladoras en el citoplasma Tat(que pueden fomentar la producción de nuevos virus ) y Rev.
• ③ A medida que los Rev 蛋白núcleos recién producidos ingresan, acumulándose en el núcleo , se une al ARNm viral y permite que el ARN no empalmado abandone el núcleo , donde de otro modo permanecería hasta el empalme.
• ④ En esta etapa, las proteínas estructurales Gagy se producen Enva partir de ARNm de longitud completa . El ARN de longitud completa es en realidad el genoma viral, que se une a Gagproteínas y se empaqueta en nuevas partículas de virus.

(4) Ensamblaje y liberación de virus

• ① El paso final en el ciclo viral es el ensamblaje de nuevos virus VIH-1, comenzando en la membrana plasmática de la célula huésped. EnvLa proteína agregada ( gp160 ) cruza el retículo endoplásmico y es transportada al aparato de Golgi, donde es escindida por proteasas y procesada en las dos glicoproteínas de la cubierta gp41 del VIH y gp120.
• ② La glicoproteína se transporta a la membrana plasmática de la célula huésped, donde gp41 ancla gp120 a la membrana . Gag(p55)y Gag-Pol(p160)las poliproteínas se unen a la superficie interna de la membrana plasmática, así como al ARN genómico del VIH , y la gemación del virión comienza desde la célula huésped .
• ③ La maduración puede ocurrir en brotes en formación o en viriones inmaduros que brotan de la célula huésped. Durante la maduración, las proteasas del VIH escinden las poliproteínas en proteínas y enzimas funcionales individuales del VIH.
• ④ Luego, los diversos componentes estructurales se ensamblan para producir viriones de VIH maduros. Este paso de escisión puede ser inhibido por inhibidores de proteasa. El virus maduro es entonces capaz de infectar otra célula.

● El VIH atenúa la respuesta inmunitaria del huésped

• gp120La proteína en la superficie de las partículas del VIH se cae y se une al receptor CD4 en la membrana celular normal , de modo que el sistema inmunitario confunde las células con células infectadas por el virus y destruye (disminuyen las células CD4).
• porqueReceptor CD4 de células T bloqueado por gp120, afectando su función inmunológica.
• La proteína gp120 del VIH puede estimular al cuerpo a producir anticuerpos específicos contra el sitio de unión de CD4 y bloquear la función de las células T.
• Las células con proteínas de envoltura viral pueden fusionarse con otras células para formar células gigantes multinucleadas sin función.

tratamiento del VIH

• HAART( Cocktail Therapy ): El tratamiento a base de inhibidores de la proteasa está disponible desde 1996. Por lo general, dos inhibidores de la transcriptasa inversa análogos de los nucleósidos ( NARTIo NRTI) más inhibidores de la proteasa o inhibidores de la transcriptasa inversa no nucleósidos . (Inhibe el proceso de transcripción inversa viral, de modo que el ARN viral no puede integrarse en el genoma, no puede transcribirse de forma inversa, pero aun así se replica a un nivel bajo. )
• HAART no cura a los pacientes, ni elimina uniformemente todos los síntomas; los altos niveles de virus VIH-1 (a menudo resistentes a HAART) recaen si se suspende el tratamiento .
• La investigación para mejorar los tratamientos actuales incluye reducir los efectos secundarios de los medicamentos actuales , simplificar aún más los regímenes de medicamentos para mejorar la adherencia y determinar la secuencia óptima de los regímenes para tratar la resistencia a los medicamentos .
• Sin embargo, después de más de 20 años de investigación, el VIH-1 sigue siendo un objetivo de vacuna .

12.2.2 (-)ssRNA del virus de la influenza

virus de la gripe

• Los virus de la influenza causan pandemias periódicas de enfermedades respiratorias.
• virus ARN,(-)ssRNA
• Subtipos basados ​​en especies específicas y combinaciones de dos proteínas (picos) ( hemaglutinina H1 a H18 y neuraminidasa N1 a N10) presentes en la superficie del virus .
• Las nuevas cepas virulentas se producen mediante la recombinación de cepas humanas y aviares .

● Subtipos del virus de la influenza A que circulan en humanos

• H1N1 causó brotes de gripe española y gripe porcina de 2009
• H2N2 causó la "gripe asiática" a fines de la década de 1950
• A fines de la década de 1960, el H3N2 provocó la "gripe de Hong Kong"
• H5N1 se propagó a mediados de la década de 2000 y se consideró una amenaza de pandemia mundial
• H7N7 tiene un potencial zoonótico inusual
• H1N2 está circulando actualmente en humanos y cerdos
• H9N2, H7N2, H7N3, H5N2 y H10N7.

● Partícula central: ARN, proteína de la cápside, proteína de la matriz, envoltura que contiene proteína de pico

● Ciclo de vida del virus de la influenza

• Los virus de la influenza consisten en ARN segmentado de cadena (-) . Cada fragmento está empaquetado con una proteína de nucleocápside. Se recombinaron fragmentos de diferentes cepas mediante coinfección.
• Las proteínas de la cápside y la matriz bloquean el segmento de ARN del virus de la influenza . La matriz está rodeada por una envoltura que contiene la proteína espiga.
• Las proteínas de la envoltura median la unión viral . La proteína de la envoltura incluye un péptido de fusión que experimenta un cambio conformacional para provocar la fusión entre la envoltura viral y la membrana de la célula huésped. Para la influenza, los viriones se internalizan por endocitosis .
• La fusión de lisosomas con endosomas ( endosome) desencadena la fusión de la envoltura viral con endosomas. Luego, el genoma viral y las proteínas se liberan en el citoplasma. Los fragmentos virales de ARN de cadena (-) no están recubiertos y entran en el núcleo .
• Los fragmentos de ARN protegidos de la escisión del ARNm del huésped inician la síntesis del ARNm de la influenza . El ARNm viral regresa al citoplasma para su traducción.
• La síntesis de ARN genómico es iniciada por la proteína de la nucleocápside ( NP). Primero, la cadena (+) de ARN se sintetiza como molde para la cadena de ARN (-), que luego se empaqueta en proteínas de nucleocápside recién sintetizadas y se exporta al citoplasma.
• Las proteínas de la envoltura de los virus de la influenza se sintetizan en el RE y luego se transportan a la membrana celular.
• El virus de la gripe se ensambla en la membrana celular y los componentes de la cápside, el estroma y el ARN de cadena (-) se empaquetan en la envoltura.

12.2.3 SARS-CoV (+)ARNss

Síndrome Respiratorio Agudo Severo SARS

● Signos y síntomas

• Los síntomas iniciales son similares a los de la gripe y pueden incluir fiebre, mialgias, síntomas de letargo, tos, dolor de garganta y otros síntomas inespecíficos.
• Fiebre superior a 38°C (100°F).
• La dificultad para respirar puede desarrollarse más tarde.
• Los pacientes tienen síntomas similares a los del resfriado en la primera etapa, pero luego se vuelven similares a los de la gripe.

● Síndrome respiratorio agudo severo coronavirus:SARS-CoV

• (+) ssRNAVirus de cadena positiva
• Genoma: 27-30 kb, 14 ORF
• Tres glicoproteínas: S (E2), M (E1) y HE (hemaglutinina esterasa)
• S: S1(se une al receptor ACE2) y S2(media la incorporación a la membrana )
• Diámetro 80-160nm

12.2.4 Nuevo virus de la neumonía coronaria COVID-19 (+)ssRNA

Coronavirus (COVID-19

● Actualmente, el número de personas infectadas ha superado los 163 millones y el número acumulado de muertes ha superado los 3,37 millones.
● Origen desconocido.
● Síntomas :

• fiebre
• tos
• falta de aliento o dificultad para respirar
• enfriar
• temblando temblando
• Dolor muscular
• Dolor de cabeza
• dolor de garganta
• nueva pérdida del gusto o del olfato

●序列：Secuencia completa del genoma de una nueva cepa de coronavirus (SARS -CoV-2) de 2019 aislada en Nepal

Coronavirus

● Estructura:

• Proteínas estructurales : Spike, Envelope, Membrane, Nucleocapsid protein
• proteína no estructural

● Diagrama del ciclo de vida del coronavirus humano
Fuente: Human Coronavirus: Host-Pathogen Interaction

Aplicación de virus biológico

1. El fago (bactericida) se puede utilizar como fármaco específico para prevenir y tratar ciertas enfermedades.Por ejemplo, los pacientes quemados aplican una dilución de Pseudomonas aeruginosa en la zona afectada.
2. En la ingeniería celular, ciertos virus se pueden utilizar como agente de fusión para la fusión celular (las células tienen la propiedad de inhibición por contacto y la fusión se producirá en presencia de virus), como el virus Sendai.
3. En ingeniería genética, los virus se pueden utilizar como portadores de genes diana , lo que les permite empalmarse en los cromosomas de las células diana.
4. Los virus añadidos a un medio de cultivo bacteriano específico pueden eliminar las impurezas .
5. Los virus se pueden utilizar como portadores de medicamentos guiados con precisión .
6. Los virus se pueden utilizar como insecticidas específicos .
7. Los virus también juegan un papel clave en la circulación de la materia y el intercambio de energía en la biosfera.
8. Los virus también se pueden usar para tratar enfermedades, como el cáncer.

12.3 Vectores virales

• Los vectores de transferencia de genes están hechos de virus.
• Los genes de virulencia se eliminan y se insertan secuencias promotoras eficientes de otros virus .
• Para mejorar la seguridad biológica del vector, los vectores virales han evolucionado en una forma que separa las secuencias virales requeridas para el empaquetamiento y la producción de las secuencias que codifican las proteínas virales .

● Vectores de expresión viral comunes

• Vector lentiviral ( Lenti Virus)
• Vector adenoviral ( AV)
• Vector de virus asociado a adenovirus (virus asociado a adenovirus, AAV)
• Vector de transcripción inversa ( RV)

• Los vectores adenovirales circularizan y se replican por separado del genoma del huésped .
● Los vectores retrovirales y lentivirales se integran en el genoma del huésped .
● Seguridad del portador del gen : Virus adenoasociado : RG1 > Adenovirus : RG1 > Lentivirus : RG2 > Retrovirus : RG3

12.3.1 Sistema de vector lentiviral

• HIV-1vectores lentivirales derivados del virus de la inmunodeficiencia humana ( );
• Para la expresión génica en células de mamíferos (células en división y que no se dividen) , integración en el genoma .
• El genoma del VIH-1 contiene nueve marcos de lectura abiertos que codifican al menos 15 proteínas diferentes involucradas en el ciclo de infección, incluidas proteínas estructurales y reguladoras.
• Varios elementos que actúan en cis están presentes en el genoma , incluidas las repeticiones terminales largas ( LTRs), la región de activación de TAT ( TAR), los sitios donantes y aceptores de empalme , las señales de empaquetamiento y dimerización (ψ), los elementos de respuesta Rev ( RRE) y la polipurina central y terminal. La región ( PPT) es necesaria para la expresión génica en varias etapas del ciclo de vida de diferentes virus.

● El vector lentiviral de primera generación

• Componentes del vector (3 plásmidos):
  (i) plásmido de empaquetamiento Packaging plasmid , (ii) plásmido Env ( plásmido de envoltura
  ) que codifica la glicoproteína viral : VSV-G , (iii) plásmido de transferencia . Env encoding plasmid
Vector plasmid
• Utilice la ingeniería genética para eliminar específicamente la señal de empaquetamiento (para mejorar la seguridad) o los LTR del plásmido de empaquetamiento para reducir la producción de lentivirus infecciosos replicativos (RCL).

● Los cuatro genes auxiliares de codificación de proteínas (Vif, Vpu, Vpr y Nef) en el sistema de modificación del vector lentiviral de segunda generación : eliminación de todos los genes accesorios del VIH en el plásmido de empaquetamiento del vector lentiviral de primera generación , y eliminación de estos genes accesorios No afecta el título y la capacidad de transfección del virus, y al mismo tiempo aumenta la seguridad del vector .

★ Vector lentiviral de tercera generación (utilizado actualmente)

• Componentes del vector (4 plásmidos)
  (i) 2 plásmidos de empaquetamiento , uno codificante Revy otro codificante Gagy Pol;
  (ii) plásmido Env (plásmido envolvente) que codifica la glicoproteína viral;
  (iii) plásmido de transferencia.
• Se mejora aún más la bioseguridad : se reduce la producción de lentivirus infecciosos replicativos (RCL) ① Se construye un plásmido que es independiente del
  vector reemplazando la región promotora del 5'LTR del vector plásmido con un promotor viral fuerte de o ; ② El plásmido vector La eliminación de la secuencia de la región U3 de la 3'LTR asegura que las partículas lentivirales se autoinactiven después de la transducción y la integración en el ADN genómico de la célula diana (U3CMVRSVtat
  Ya no tiene la capacidad de infectar, es decir, solo puede infectar una vez);
  ③ El número de genes lentivirales necesarios para el empaquetamiento, la replicación y la transducción se reduce a tres (gag, pol, rev);
  ④ En comparación con los vectores retrovirales Mulv, los vectores lentivirales son más propensos a integrarse en la actividad del genoma del huésped en las regiones transcritas , el riesgo de activar el silenciamiento del protooncogén es menor que el de los vectores retrovirales Mulv.

12.3.2 Vectores virales adenoasociados

• El virus adenoasociado es una clase de virus defectuosos en el ADN lineal monocatenario .
• El ADN genómico tiene menos de 5 kb , sin envoltura, y la forma es de partículas icosaédricas desnudas.
• El AAV no puede replicarse de forma independiente , y la replicación y la infección citolítica solo son posibles en presencia de un virus auxiliar (p. ej., adenovirus, virus del herpes simple, virus vaccinia).

● Genoma del virus adenoasociado

• Los dos extremos del genoma son repeticiones invertidas terminales ( ITR), y el genoma medio codifica dos proteínas: Rep y Cap.
  ITRsDesempeña un papel decisivo en la replicación y empaquetamiento de virus .
  CapLa proteína es la proteína de la cápside del virus, y la proteína está involucrada en la replicación e integración
  Rep del virus.

• AAV puede infectar una variedad de tipos de células. RepEn presencia de la proteína, el genoma viral se integra fácilmente en un sitio específico del cromosoma 19 humano: AAVS1loci . Este es el unico conocidointegración de punto fijode virus de ADN de mamíferos.

• Mapa del genoma del AAV-2 de tipo salvaje
  
  (A) Los genes Rep y Cap están flanqueados por ITR. Sus respectivos promotores (P5, P19 y P40) producen transcritos distintos de Rep y Cap. Los asteriscos indican codones ACG alternativos usados ​​para producir VP3.
  (B) La estructura secundaria de AAV-2 ITR, que muestra RBE(elemento de unión a Rep, GAGCGAGCGAGCGCGC; RBE', CTTG) y TRS(sitio de resolución terminal, GTTGG). Los ITR son importantes para la replicación del ADN de AAV.

● Ciclo de vida de AAV

• En el caso de la coinfección por adenovirus , el AAV se vuelve infeccioso : replicación del genoma, expresión de genes virales y producción de viriones.
• En ausencia de adenovirus , AAV puede establecer latencia integrándose en el cromosoma 19 (AAVS1) .
• El genoma AAV latente puedeRestauración de la replicación por superinfección con adenovirus。
• Ambas fases del ciclo de vida de AAV están reguladas por interacciones complejas entre el genoma de AAV y AAV, adenovirus y proteínas del huésped.

Vector de virus adenoasociado

A. Diagrama esquemático de AAV. El genoma monocatenario está rodeado por una cápside proteica.
b. Genoma de ADN de AAV. La codificación repy el marco de lectura abierto del genoma capde 4,7 kb están terminados por ITR. c.Componentes de los vectores AAV. ① Inserte el transgén terapéutico y el promotor asociado y la secuencia de poliadenilación (polyA) entre las ITR virales. ② El vector expresa AAV rep y cap ③ El vector expresa adenovirus E2A, E4 y VA RNA abreviaturas: AAP, proteína activadora de ensamblaje; AAV, virus adenoasociado; ITR, repetición terminal invertida; PolyA, secuencia de poliadenilación; VA, virus relevante.aap

● Ventajas de los vectores virales adenoasociados

• Vector de virus asociado a adenovirus AAV Helper-Free System, un sistema de empaquetado que no requiere vectores auxiliares de adenovirus.
• El vector de virus adenoasociado recombinante (rAAV) se deriva del virus adenoasociado de tipo salvaje no patógeno, debido a su buena seguridad y amplia gama de células huésped (Células en división y no división), baja inmunogenicidad y expresión a largo plazo de genes extraños in vivo Se considera uno de los vectores de transferencia de genes más prometedores y se ha utilizado ampliamente en terapia génica e investigación de vacunas en todo el mundo.

● Desventajas de los vectores virales adenoasociados

• El vector AAV tiene una capacidad pequeña y actualmente solo puede acomodar fragmentos de ADN extraños de hasta 4,7 kb ;
• El AAV de tipo salvaje es infeccioso en el 40 % - 80 % de los adultos y no favorece la producción de vacunas; puede causar rechazo inmunitario en presencia de adenovirus .

● Genes adecuados para la expresión de AAV

1. La longitud del gen terapéutico no debe ser demasiado grande. La capacidad total de AAV es de 4,7 kb, yIncluyendo la ITR propia de AAV, la región promotora y la señal de cola de ARN；
2. El gen necesita expresarse continuamente y la proteína puede ser secretada o no secretada;
3. Expresión a largo plazo del gen objetivo sin efectos secundarios tóxicos;
4. No se requiere la expresión inmediata del gen objetivo;
5. No se requiere un alto nivel de expresión de genes (Vectores de expresión basados ​​en virus, el nivel de expresión será menor）；
6. Los vectores AAV tienen una alta eficiencia de transducción para las células diana.

12.3.3 Vectores del virus del herpes simple

Herpes simplex virus HSV: ADN virus

• El virus del herpes simple es un virus que causa llagas recurrentes en las membranas mucosas de la boca o los genitales. La transmisión inicial es a través del contacto oral o genital, seguida de un brote viral latente reactivado en las neuronas ganglionares .
• Los viriones del herpes contienen un genoma de ADN de doble cadena empaquetado en una cápside icosaédrica . La cápside está rodeada por muchas proteínas de matriz y una envoltura.
• La unión del HSV puede involucrar múltiples receptores.
• Los andamios de microtúbulos transportan los viriones del herpes al núcleo y se insertan en el genoma del ADN . El ensamblaje de HSV ocurre en la envoltura nuclear u otras membranas. Los viriones se liberan de las células por exocitosis y la liberación rápida conduce a la patología de la mucosa.
• El genoma de ADN del HSV se sintetizó mediante el método de redondeo (alta eficiencia de replicación), utilizando una polimerasa de ADN viral complementada con componentes virales y producidos por el huésped.
• La expresión de ARNm infeccioso da como resultado la producción de proteínas de la cápside, la matriz y la cubierta, y por tanto el ensamblaje del HSV.
• LATLa expresión de la proteína a menudo conduce a una infección latente en las células nerviosas donde el silenciamiento del ADN persiste durante meses o años.

vector del virus del herpes simple

● El sistema de amplicón incluye:

1. Plásmido de amplicón que contiene el origen de la replicación del ADN del virus del herpes simple (HSV) ( ), la secuencia de empaquetamientoOri del HSV ( ), el gen de resistencia a los antibióticos ( ) y el casete promotor-transgén ;PacAmp
2. Virus auxiliar para proporcionar la función de replicación de virus.

● El genoma del virus auxiliar con la señal de empaquetamiento eliminada se clona en un cromosoma artificial bacteriano ( BAC).
● Cuando las células eucariotas se cotransfectan con amplicón y ADN de HSV-BAC , las partículas de virus resultantes solo pueden reconocer y empaquetar el plásmido de amplicón, lo que da como resultado una reserva de amplicón sin virus auxiliar .

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Tarea : encontrar la secuencia de ácido nucleico de la proteína S del SARS-CoV2 (secretada fuera de la célula) y construirla en un vector de expresión eucariótico para permitir que se secrete y exprese fuera de la célula. Se requiere diseñar cebadores y describir el esquema de diseño.
Secretado al exterior de la célula : un péptido secretor se fusiona con la proteína S, se coloca detrás del péptido secretor y en el mismo marco.

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