En la actualidad, se han informado más de 150 tipos de bases modificadas de ARN en el mundo biológico, entre las cuales la N6-metiladenina (m6A) es la más abundante en los vertebrados, y también es la base modificada más estudiada. En la actualidad, la detección de m6A se basa principalmente en métodos de secuenciación de próxima generación, que tienen problemas como falsos positivos, operaciones complicadas y se limitan a la detección del sitio. Por lo tanto, la tecnología de secuenciación de nanoporos (Oxford Nanopore Technologies, ONT) se ha convertido en un método de reemplazo ideal. La plataforma de secuenciación ONT secuencia directamente el ADN o el ARN al monitorear el cambio de corriente causado por una sola molécula que pasa a través de un nanoporo incrustado en una membrana de polímero sintético.La corriente generada por la perforación de la base modificada puede ser diferente de la base clásica correspondiente, por lo que puede ser basado en La diferencia de corriente detectada se utiliza para detectar bases modificadas, incluido m6A. Desde entonces, se han desarrollado más de una docena de herramientas computacionales (Fig. 1) para identificar la posición de m6A y determinar su estequiometría a partir de la secuenciación directa de ARN (DRS).
Figura 1 Las herramientas, el proceso y la clasificación de la detección de m6A utilizando la plataforma ONT DRS
Aunque se han desarrollado muchas herramientas computacionales avanzadas y altamente sofisticadas para detectar y cuantificar m6A, actualmente faltan estudios que evalúen y comparen a fondo estas herramientas. Para llenar este vacío, el equipo de investigación publicó un artículo "Comparación sistemática de herramientas utilizadas para el mapeo de m6A a partir de la secuenciación directa de ARN de nanoporos" en Nature Communications el 5 de abril de 2023.
Estas herramientas se evaluaron exhaustivamente en múltiples conjuntos de validación (Fig. 2) utilizando muestras de múltiples réplicas de múltiples especies (dos réplicas de cada una de células embrionarias de ratón y Arabidopsis thaliana) como datos de evaluación (Fig. 2), incluido el uso de dos evaluación continua métricas (Característica operativa del receptor (Receiver Operating Characteristic, ROC) y tasa de recuperación de precisión (Curva de recuperación de precisión, PR)) evalúan cuantitativamente su rendimiento, comparan la precisión de los sitios principales que detectan y sus La precisión, la recuperación y la puntuación F1 de los sitios detectados por debajo del umbral óptimo. Resulta que la mayoría de las herramientas tienen un compromiso entre precisión y recuperación.
Figura 2 Evaluación del rendimiento de las capacidades de la herramienta ONT para detectar m6A
Además, este estudio evalúa el sesgo inherente de estas herramientas en el proceso de detección y demuestra que la introducción de muestras de control negativo puede mejorar el rendimiento de la mayoría de las herramientas. Además, también se encontró que la capacidad de detección variaba entre diferentes motivos, lo que se debía al hecho de que en algunas secuencias, las diferencias actuales no se detectaban fácilmente. Para las herramientas que pueden cuantificar m6A, se observó una amplia variación en sus estimaciones metrológicas, aunque se pudieron obtener resultados aceptables en algunos motivos. La profundidad de secuenciación y la estequiometría de modificación son otros dos factores importantes que influyen (Figura 3).
Figura 3 Análisis adicional de la herramienta ONT para detectar m6A
En conjunto, el estudio proporciona información sobre las herramientas informáticas que se utilizan actualmente para detectar m6A en función de los datos de ONT DRS y destaca el potencial de mejora adicional de estas herramientas, que puede formar la base para futuros estudios. La Facultad de Ciencias de la Vida de la Universidad Sun Yat-sen es la unidad del primer autor. Este trabajo fue apoyado por el Programa Clave de Investigación y Desarrollo del Ministerio de Ciencia y Tecnología, la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China y el Programa de Becas de la Bahía de Shenzhen.
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